茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBPs基因鉴定和功能研究

摘要

茶尺蠖(Ectropis obliqueProut)是茶树最主要的鳞翅目害虫，幼虫取食茶叶为害，且具有暴食性，爆发期可导致成片茶树枝梗光秃，降低了茶叶的产量与质量。目前茶尺蠖的防治基本停留在化学防治阶段，大量农药的喷洒会造成农药残留和环境污染，危害人类健康。因此，开发新型的生物防治手段非常必要。昆虫嗅觉功能对于昆虫的觅食、求偶、寻找产卵地等发挥着重要的作用，研究其嗅觉生理机制将为未来开发嗅觉引诱或干扰剂提供理论依据。因此，本文主要围绕茶尺蠖嗅觉系统中的普通气味结合蛋白GOBP展开了一系列研究，首先对EoblGOBP1和EoblGOBP2的基因表达谱分析；其次利用原核表达技术获得了EoblGOBP2重组蛋白并制备其多克隆抗体；并通过荧光竞争结合实验体外研究了其与若干茶树重要挥发物的结合功能，同时测试了挥发物对茶尺蠖的触角电位反应(EAG)；然后研究了EoblGOBP2重组蛋白与茶园常用新烟碱类杀虫剂吡虫啉的相互作用关系及对蛋白结合功能的影响；最后利用扫描电镜观察了茶尺蠖触角感受器的形态及分布，并采用胶体金标记的免疫电镜技术对EoblGOBP2蛋白进行了触角定位。具体研究结果如下：
　　1.利用RT-PCR技术克隆得到EoblGOBP1和EoblGOBP2基因的ORF，分别为501 bp和483 bp，预测编码166和160个氨基酸，偏酸性，均含有6个保守的半胱氨酸，可形成6个保守的α-螺旋结构，EoblGOBP1序列第1-17个氨基酸为信号肽，而EoblGOBP2序列第1-19个氨基酸为信号肽。多序列联配分析发现，EoblGOBP1和EoblGOBP2与其他鳞翅目的GOBP1和GOBP2相似度均较高，但进化树分析发现EoblGOBP1与其他鳞翅目昆虫的GOBP1亲缘关系较远，而和其他鳞翅目昆虫的GOBP2亲缘关系近，EoblGOBP2与其他鳞翅目昆虫的GOBP2亲缘关系较远，而和其他鳞翅目昆虫的GOBP1亲缘关系近。
　　2.利用real-time PCR的标准曲线绝对定量法对EoblGOBP1和EoblGOBP2基因在茶尺蠖雌、雄虫的触角、头、胸、腹、足、翅六个组织中RNA转录水平的表达谱进行了分析。结果显示EoblGOBP1主要在触角中表达，其他部位也有表达，但表达量极低，认为 EoblGOBP1基因为触角特异表达；EoblGOBP2基因在雌、雄虫触角以及雌虫的腹和翅中均有较高丰度的表达。
　　3.构建了pET32a-EoblGOBP2的原核表达载体，并成功表达了EoblGOBP2重组蛋白。利用亲和层析法纯化了重组蛋白。用重组蛋白直接免疫新西兰大白兔，获得抗EoblGOBP2蛋白的多克隆抗体。
　　4.以1-NPN为荧光报告子，利用荧光竞争法研究了EoblGOBP2蛋白与19种茶树挥发物的结合特性。结果显示，EoblGOBP2蛋白对邻苯二甲酸二丁酯、水杨酸甲酯、β-紫罗兰酮、苯乙酮、苯甲醛、反-2-己烯醛和反-2-癸烯醛7种配基有较强亲和力，而与醇类物质结合能力弱。这7种配基的EAG反应结果显示，雌、雄虫对与EoblGOBP2蛋白结合能力最强的邻苯二甲酸二丁酯的EAG反应均最弱，推测邻苯二甲酸二丁酯与EoblGOBP2蛋白为特异性结合。雌、雄虫对反-2-己烯醛、苯甲醛的EAG反应均最强，表明触角中的其他嗅觉相关蛋白亦可能对反-2-己烯醛和苯甲醛有亲和力。
　　5.利用多重光谱法研究了新烟碱类杀虫剂吡虫啉与 EoblGOBP2蛋白的结合机理。结果显示，吡虫啉可以使EoblGOBP2蛋白的荧光发生猝灭，猝灭机理为静态猝灭，表明两者可以形成稳定结合的络合物。热力学分析显示，ΔG<0，表明二者结合是自发形成的，ΔH<0，ΔS<0，表明两者作用主要由氢键和范德华力驱动，而分子对接结果显示二者之间的确可形成4个氢键。根据FRET理论，计算得到两者间的结合距离为7.0 nm。同步荧光光谱和圆二色谱结果显示，吡虫啉结合 EoblGOBP2蛋白后使其结合腔的极性发生变化，且吡虫啉可以使EoblGOBP2蛋白的α螺旋减少，导致其构象发生变化。另外，研究了吡虫啉对EoblGOBP2蛋白结合功能的影响，发现吡虫啉存在时，EoblGOBP2蛋白与反-2-己烯醛的结合常数由1.36×104 L·mol-1下降到了1.13×104 L·mol-1，表明吡虫啉降低了EoblGOBP2蛋白的配基结合能力。
　　6.通过扫描电镜对茶尺蠖触角进行观察，发现了五种感受器，分别为毛形感器（Sensillum trichodeum）、刺形感器（Sensillum chaeticum）、栓锥感器（Sensillum styloconicum）、鳞形感器（Sensillum squamiformium）和锥形感器（Sensillum basiconicum）。其中毛形感器分为AⅠ型和AⅡ型两种，雄虫触角上AⅠ型毛形感器要远多于雌虫。刺形感器主要在雌虫触角上分布，雄虫上基本没有。利用胶体金标记免疫电镜技术对EoblGOBP2蛋白进行了触角定位，发现雄虫的AⅡ型毛形感器中存在大量的EoblGOBP2蛋白，而雄虫AⅠ型毛形感器中亦有少量分布。
　　总之，本研究对于茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP的分子鉴定、生理功能及其在茶尺蠖嗅觉行为以及对新烟碱类农药的调控互作机制进行了系统研究，为未来基于茶尺蠖嗅觉功能干扰和功能抑制等新型生物防治手段的开发和应用奠定了重要的理论基础。

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1 绪论

1.1 茶尺蠖概述

1.2植物挥发性气味与昆虫的关系

1.3昆虫的嗅觉系统及其相关蛋白质

1.4 新烟碱类杀虫剂研究进展

1.5 研究的内容及意义

2 茶尺蠖普通气味结合蛋白EoblGOBP1和EoblGOBP2基因的

2.1 材料与方法

2.2 结果分析

2.3 本章小结

3 茶尺蠖EoblGOBP1和EoblGOBP2基因RNA转录水平表达

3.1 材料与方法

3.2 结果分析

3.3 本章小结

4 茶尺蠖普通气味结合蛋白 EoblGOBP2 的原核表达、蛋白纯

4.1 材料与方法

4.2 结果分析

4.3 本章小结

5 茶尺蠖EoblGOBP2结合特性的研究与触角电位反应

5.1 材料和方法

5.2 结果分析

5.3 本章小结

6 吡虫啉与茶尺蠖 EoblGOBP2 蛋白的结合机理研究及其对

6.1 材料与方法

6.2 结果分析

6.3 本章小结

7 茶尺蠖触角的扫描电镜与EoblGOBP2的触角免疫电镜定位

7.1 材料与方法

7.2 结果分析

7.3 本章小结

8 总结与展望

8.1 全文总结

8.2 课题展望

参考文献

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