嗜肺军团菌效应蛋白MavC催化新型泛素化反应的分子机制研究

目录

声明

摘要

符号说明

第一章绪论

1．1泛素化与去泛素化

1．1．1泛素化

1．1．2去泛素化

1．2嗜肺军团菌

1．2．1嗜肺军团菌的简介

1．2．2嗜肺军团菌侵染宿主的工作机制

1．2．3嗜肺军团菌的效应因子

1．3转谷氨酰胺酶(Transglutaminases，TGs)

1．4军团菌效应蛋白MavC

1．5周期抑制因子(Cif)及其同源物

1．6课题研究内容及意义

第二章实验材料与方法

2．1目的基因的克隆与纯化

2．1．1主要使用仪器与材料

2．1．2实验室常用感受态细胞

2．1．3实验室常用质粒载体

2．1．4分子克隆实验

2．2蛋白质的表达与纯化方法

2．2．1主要使用仪器与材料

2．2．2目的蛋白基因的转化

2．2．3目的蛋白的试表达与纯化

2．2．4亲和层析

2．2．5分子筛层析

2．2．6离子交换层析

2．2．7蛋白质电泳检测

2．3蛋白质晶体结构解析

2．3．1主要使用的仪器与耗材

2．3．2蛋白质结晶原理

2．3．3蛋白质结晶的方法

2．3．4蛋白质晶体初筛

2．3．5蛋白质晶体的重复及优化

2．3．6目的蛋白-Ub(泛素小分子)晶体获得方法

2．3．7晶体X-ray衍射数据的收集与处理

2．4体外泛素化实验体系

2．5体外去泛素化体系

2．6体外去泛素化动力学实验体系

2．7体外脱氨基实验体系

2．8底物特异性体外脱氨基实验体系

2．9验证蛋白-蛋白以及蛋白-小分子结合的检测实验

2．9．1 Pull Down实验

2．9．2分子筛结合实验

2．9．3等温滴定量热(ITC)实验

第三章目的蛋白MavC、UBE2N、Ub的表达与纯化

3．1 MavC重组质粒的构建

3．2 MavC蛋白的表达与纯化

3．3 UBE2N重组质粒的构建

3．4 UBE2N的表达与纯化

3．5 Ub重组质粒的构建

3．6 Ub的表达与纯化

第四章二元、三元复合物的结晶与优化

4．1三元复合物MavCC74A／UBE2N／Ub的结晶

4．1．1 MavCc74A、UBE2N、Ub蛋白的纯化

4．1．2 MavC／UBE2N／Ub三元复合物制备

4．1．4 MavC／UBE2N／Ub三元复合物晶体的重复与优化

4．2二元复合物MavC／UBE2N-Ub的结晶

4．2．3 MavC／UBE2N-Ub二元复合物晶体初筛

4．2．4 MavC／UBE2N-Ub二元复合物晶体的重复与优化

第五章效应蛋白MavC催化新型泛素化机制的功能研究

5．3 MavCC74A／UBE2N／Ub三元复合物整体结构的概览

5．4 MavC通过四个不同的补丁结合Ub

5．5 MavC的底物特异性

5．6 MavC识别UBE2N的机制

5．7反应期间UBE2N的构象变化

5．8 MavC的去泛素化活性

第六章结果讨论与展望

6．1实验结果总结与讨论

6．2课题展望

参考文献

附录

致谢

作者及导师简介