哮喘气道重塑中气道平滑肌细胞凋亡的变化及地塞米松的干预作用

摘要

目的：(1)观察支气管哮喘大鼠气道重塑中气道平滑肌细胞(ASMCs)凋亡的变化,探讨ASMCs凋亡在哮喘气道重塑中的作用;(2)观察地塞米松对ASMCs凋亡的影响并探讨其可能机制. 方法：清洁级雄性SD大鼠36只,体重125-175g,随机分为3组:正常对照组(C)、哮喘组(A)和地塞米松干预组(D),每组12只.以卵蛋白(OVA)致敏和激发的方法制备大鼠慢性哮喘模型.末次激发24小时后腹腔注射麻醉,气管切开插管,测定气道反应性.肺组织HE染色,光镜下找到完整的支气管横断面,应用图象分析软件测定支气管基底膜周径(Pbm)、管壁总面积(Wat)、平滑肌面积(Wam),并用Pbm将测得的Wat和Wam标准化,以Wat/Pbm、Wam/Pbm表示,分别代表管壁厚度和平滑肌厚度.透射电子显微镜下观察肺组织超微结构.末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TLJNEL法)检测ASMCs凋亡并计算凋亡指数(AI).免疫组化和原位杂交分别检测气道平滑肌Bc1-2、Bax及其mRNA的表达情况.荧光免疫组化染色和荧光显微镜观察细胞色素C(Cytc)在气道平滑肌的表达情况. 结果：(1)气道反应性:静脉注射不同浓度乙酰甲胆碱(Mch)后,A组大鼠气道阻力增加幅度和顺应性下降幅度均明显高于C组(P<0.01),D组大鼠气道反应性较A组明显降低(P<0.01或P<0.05),但仍高于C组(P<0.01或P<0.05). (2)肺组织HE染色光镜观察:光镜下C组大鼠支气管上皮完整,无明显炎症反应,肺组织形态正常:A组大鼠可见支气管上皮脱落,支气管壁和血管壁周围有大量炎性细胞浸润,基底膜和平滑肌明显增厚,管腔狭窄;D组炎症反应较轻,气道壁各层(尤其是平滑肌层)厚度较A组明显降低. (3)支气管壁厚度(Wat/Pbm)和平滑肌厚度(Wam/Pbm): C组大鼠Wat/Pbm为63.87±6.34μm<'2>,Wam/Pbm为16.66±1.86μm<'2>/μm;A组大鼠Wat/Pbm(87.18±11.29 μm<'2>/μm)和Wam/Pbm(34.41±3.93μm<'2>μm)均较C组明显增高(P<0.01);D组大鼠上述指标[Wat/Pbm(74.05±4.60 μm<'2>/μm),Wam/Pbm(25.42±2.52μm<'2>/μm)]均明显低于A组(P<0.01),但仍高于C组(P<0.01). (4)电镜观察: 电镜下C组显示正常的肺泡膈和肺泡Ⅱ型上皮细胞,支气管平滑肌薄,可见核固缩的ASMCs;A组显示肺泡膈明显增厚,支气管壁大量炎性细胞浸润,支气管平滑肌较C组明显增厚,ASMCs数量明显增多,未见核固缩的ASMCs;D组显示基本正常的肺泡膈和肺泡Ⅱ型上皮细胞,支气管壁少量炎性细胞浸润,支气管平滑肌较薄,可见核固缩的ASMCs. (5)ASMCs凋亡情况: C组大鼠ASMCs的AI为(0.201±0.022);A组大鼠ASMCs的AI为0.030±0.016,低于C组(P<0.01);D组AI为0.118±0.043,与A组比较明显增高(P<0.01),但仍低于C组(P<0.01). (6)Bcl-2及其mRNA的表达情况: C组大鼠气道平滑肌层Bcl-2表达的吸光度(OD值)为(0.060±0.012);A组大鼠OD值为0.112±0.028,显著高于C组(P<0.01);D组OD值为0.080±0.010,明显低于A组(P<0.01),但仍高于C组(P<0.01).C组大鼠气道平滑肌层Bcl-2mRNA表达的0D值为0.065±0.019;A组大鼠OD值为0.157±0.019,显著高于C组(P<0.01);D组OD值为0.099±0.029,低于A组(P<0.01),但仍高于C组(P<0.01). (7)Bax及其mP,NA的表达情况: C组大鼠气道平滑肌层Bax表达的OD值为0.120±0.020;A组大鼠OD值为0.062±0.012,显著低于C组(P<0.01);D组OD值为0.093±0.010,明显高于A组(P<0.01),但仍低于C组(P<0.01).C组大鼠气道平滑肌层Bax mRNA表达的OD值为0.155±0.025;A组大鼠OD值为0.074±0.019,显著低于C组(P<0.01);D组OD值为0.118±0.031,高于A组(P<0.01),但仍低于C组(P<0.01). (8)Cytc表达情况: Cytc荧光免疫组化染色结果显示,A组大鼠气道平滑肌层荧光强度明显弱于C组,D组荧光强度较A组增强,但仍弱于C组. (9)相关分析: 相关分析结果显示,ASMCs的AI和气道平滑肌厚度之间呈显著负相关(r=-0.860,P<0.01);ASMCs的AI和气道平滑肌Bcl-2相对含量呈显著负相关(r=-0.783,P<0.01);ASMCs的AI和气道平滑肌Bax相对含量呈正相关(r=0.837,P<0.01). 结论：(1)哮喘气道重塑中ASMCs凋亡减少,其凋亡指数与支气管平滑肌厚度呈负相关,ASMCs凋亡的减少可能参与了哮喘气道重塑过程; (2)地塞米松可以增加ASMCs的凋亡,从而延缓哮喘气道重塑的发生; (3)地塞米松可以增加线粒体细胞凋亡途径中的促凋亡蛋白Cytc以及Bax的表达,同时减少该途径中的抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而增加ASMCs的凋亡.亦即,线粒体细胞凋亡途径可能参与了地塞米松诱导的ASMCs凋亡过程.

目录

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缩略词表

前言

材料和方法

1.实验动物

2.主要仪器和试剂

3.动物分组及模型制备

4.气道反应性测定

5.肺组织标本的留取

6.光镜标本制作及观察

7.电镜标本制作及观察

8.气道平滑肌细胞凋亡检测

9.SABC免疫组织化学染色

10.Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的组织原位杂交测定

11.Cytc的荧光免疫组织化学检测

12.统计学处理

结果

1.各组大鼠症状比较

2.各组大鼠气道反应性比较

3.肺组织HE染色观察

4.支气管管壁厚度、平滑肌厚度比较

5.大鼠电镜观察结果

6.大鼠气道平滑肌细胞凋亡分析

7.Bcl-2及其mRNA表达情况

8.Bax及其mRNA表达情况

9.Cytc的荧光免疫组织化学染色结果

10.相关性分析

附图（一）

附图（二）

附图（三）

分析与讨论

1.支气管哮喘大鼠气道重塑模型的建立

2.气道平滑肌细胞凋亡在哮喘气道重塑中的作用

3.地塞米松对哮喘气道重塑中气道平滑肌细胞凋亡的影响

4.地塞米松影响气道平滑肌细胞凋亡的机制

结论

今后研究方向

参考文献

附录

致谢

综述糖皮质激素防治支气管哮喘气道重塑的研究进展