酒精性肝病创伤弧菌脓毒症大鼠肝组织TLR和促/抗炎细胞因子的基因表达及抗菌药物干预

摘要

目的：探讨酒精性肝病创伤弧菌脓毒症大鼠肝组织TLR和促/抗炎细胞因子的基因表达以及抗菌药物头孢哌酮钠联用乳酸左旋氧氟沙星对其的干预效应。 方法： 1、清洁级雄性SD大鼠100只，根据随机数字表将大鼠分为两组，即酒精性肝病组(90只)和正常对照组(10只)。酒精性肝病组大鼠按参考文献[1]用56％的酒精(5g/kg体重)每24小时灌胃1次，正常对照组以等容积的生理盐水灌胃，共10周。随机取正常对照组(N组)存活大鼠6只。取酒精性肝病组存活大鼠60只，根据随机数字表将大鼠分为10组，每组6只。1组为酒精性肝病组(A组)。4组大鼠下肢皮下注射创伤弧菌悬液，为酒精性肝病创伤弧菌脓毒症组(AV组)，于染菌后2h、6h、12h、24h处死。4组在注射创伤弧菌后4h起，予腹腔注射(ip)头孢哌酮钠和乳酸左旋氧氟沙星，每日2次，为酒精性肝病创伤弧菌脓毒症抗菌药物治疗组(AVA组)，分别在注射创伤弧菌后6h、12h、24h、10d处死。余1组酒精性肝病大鼠注射等量抗菌药物，为酒精性肝病抗菌药物对照组(AA组)。各时相点动物数均为6只。无菌取部分肝组织于液氮中保存待用。 2、第10周末随机选取酒精性肝病组大鼠2只，麻醉后处死，取肝组织送检病理。取酒精性肝病组及正常对照组大鼠下腔静脉血，检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)。 3、观察AV组和AVA组大鼠在染菌及药物干预后的体温、呼吸、精神状态等情况的改变。 4、采用Trizol试剂提取各组大鼠肝组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，以总RNA为模板，逆转录成cDNA。然后以cDNA为模板，以大鼠TLR2、TLR4、MD-2、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10引物进行PCR扩增反应。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶成像系统成像，QuantityOne分析软件进行分析，以(目的基因/β-actin)为该基因表达的相对值。 5、实验资料采用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS12.0进行t检验、方差分析等处理。p＜0.05为差异有显著性意义。 结果： 1、大鼠肝脏病理及肝功能检查酒精性肝病组大鼠肝组织可见脂肪肝，胞质内可见大小不一的脂滴空泡，窦内皮细胞肿胀、增生，汇管区有炎细胞浸润。酒精性肝病组大鼠血清AST、ALT水平较正常对照组明显升高，差异有显著性(P＜0.01)。 2、AV组染菌后6h，大鼠开始出现较明显的毒血症状，表现为呼吸加快，皮温升高，下肢肿胀。随着时间的延长，脓毒症症状表现得越明显。到24h大鼠表现为紫绀、间断抽搐等；AVA组在药物干预后上述症状逐渐减轻，大鼠均存活。 3、N组、A组、AA组大鼠肝组织TLR2mRNA表达量较低。AV组染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝组织TLR2mRNA表达量均明显高于N组与A组(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h为最高。AVA组染菌后6h、12h肝组织TLR2mRNA表达量仍明显高于N组及AA组(P＜0.05)，后逐渐降低。与相同时间点的AV组相比，染菌后6h、12h、24h时的AVA组TLR2mRNA表达量均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。 4、N组、A组、AA组大鼠肝组织TLR4mRNA表达量较低。AV组染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝组织TLR4mRNA表达量均明显高于N组与A组(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h为最高。AVA组染菌后6h、12h肝组织TLR4mRNA表达量明显高于N组(P＜0.05或P＜0.01)，染菌后6hTLR4mRNA表达量明显高于AA组(P＜0.05)，后逐渐降低。与相应时间点的AV组相比，染菌后6h、12h、24h时的AVA组TLR4mRNA表达量均明显降低(P＜0.01)。 5、N组、A组、AA组大鼠肝组织MD-2mRNA表达量较低。AV组染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝组织MD-2mRNA表达量均明显高于N组与A组(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h为最高。AVA组染菌后6h、12h肝组织MD-2mRNA表达量仍明显高于N组与AA组(P＜0.01)，后逐渐降低。与相同时间点的AV组相比，染菌后6h、12h、24h时的AVA组MD-2mRNA表达量均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。 6、N组、A组、AA组大鼠肝组织TNF-αmRNA表达量较低。AV组染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝组织TNF-αmRNA表达量均明显高于N组与A组(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h为最高。AVA组染菌后6h、12h肝组织TNF-αmRNA表达量仍明显高于N组与AA组(P＜0.01)，后逐渐降低。与相应时间点的AV组相比，染菌后12h、24h时的AVA组TNF-αmRNA表达量均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。 7、N组、A组、AA组大鼠肝组织IL-1βmRNA表达量较低。AV组染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝组织IL-1βmRNA表达量均明显高于N组与A组(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h为最高。AVA组染菌后6h、12h、24h肝组织IL-1βmRNA表达量仍明显高于N组与AA组(P＜0.05或P＜0.01)，后逐渐降低。与相同时间点的AV组相比，染菌后12h、24h时的AVA组IL-1βmRNA表达量均明显降低(P＜0.01)。 8、N组、A组、AA组大鼠肝组织IL-6mRNA表达量较低。AV组染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝组织IL-6mRNA表达量均明显高于N组(P＜0.05或P＜0.01)，染菌后6h、12h、24h的大鼠肝组织IL-6mRNA表达量均明显高于A组(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h为最高。AVA组染菌后6h、12h肝组织IL-6mRNA表达量仍明显高于N组及AA组(P＜0.05或P＜0.01)，后逐渐降低。与相应时间点的AV组相比，染菌后24h时的AVA组IL-6mRNA表达量明显降低(P＜0.01)。 9、N组、A组、AA组大鼠肝组织IL-10mRNA表达量较低。AV组染菌后12h、24h的大鼠肝组织IL-10mRNA表达量均明显高于N组与A组(p＜0.05)，以染菌后24h为最高。AVA组染菌后6h、12h、24h肝组织IL-10mRNA表达量仍明显高于N组及AA组(p＜0.05或p＜0.01)，后逐渐降低。与相应时间点的AV组相比，染菌后24h时的AVA组IL-10mRNA表达量明显降低(P＜0.01)。 结论： 1.酒精性肝病创伤弧菌脓毒症大鼠肝组织TLR2、TLR4、MD-2mRNA表达量在脓毒症早期即明显升高，后期有所下降。酒精性肝病创伤弧菌脓毒症早期大鼠肝组织TNF-α、IL-1βmRNA表达量明显升高，脓毒症早中期肝组织IL-6mRNA表达量增多，脓毒症中后期肝组织IL-10mRNA表达量逐渐增多。 2.及早使用头孢哌酮钠和乳酸左旋氧氟沙星可明显减低酒精性肝病创伤弧菌脓毒症大鼠肝组织TLR2、TLR4、MD-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10mRNA表达水平，有利于机体致炎/抗炎平衡恢复。 3.组织Toll样受体及其配体表达上调可能通过Toll样受体介导的炎症信号通路增强内毒素刺激局部组织合成、产生炎症因子效应。 4.头孢哌酮钠联用乳酸左氧氟沙星可有效改善创伤弧菌脓毒症大鼠的感染症状，对大鼠创伤弧菌脓毒症有明显的治疗作用。 5.头孢哌酮钠联用乳酸左氧氟沙星对创伤弧菌脓毒症病人的临床治疗有较大的指导意义。

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综述内毒素信号转导的研究现状