HUVEC原代培养及深低温冻存复苏对其免疫原性影响的实验研究

摘要

目的： 1、人脐静脉血管内皮细胞体外分离、原代培养，并予以鉴定及冻存复苏，构建脐静脉细胞库，为构建组织工程血管提供种子细胞。 2、初步探讨深低温冻存对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）免疫原性影响，为研究深低温冻存对血管等组织保存的免疫原性影响提供基础理论依据。 方法： 1、利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血.管内皮细胞，0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代，根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31、CD34细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定。 2、采用含10%DMSO冻存液分别应用常规梯度降温及程序降温盒进行冻存2周，37℃水浴快速复温来复苏，观察冷冻前后细胞形态，计数培养冻存前后细胞数量，绘制冻存前后细胞生长曲线，探索深低温冻存及复苏人脐静脉血管内皮细胞较佳方法。 3、单向混合人淋巴细胞-脐静脉血管内皮细胞培养，即使用1×106/mlPBMC和1×105/ml灭活HUVEC共同培养72小时，加入MTT法，酶联免疫板检测570nm处吸光度，判断冻存复苏前后血管内皮细胞对人PBMC增值情况。 4、流式细胞仪检测新鲜和冻存复苏2周后细胞HLA-ABC及HLA-DR抗原的表达，检测其HLA-ABC及HLA-DR抗原的表达变化，判断其免疫原性的强弱。 5、并利用不同浓度（0，50U/ml，100 U/ml，200 U/ml，300 U/ml，400 U/ml）IFN-γ诱导培养冻存及新鲜的血管内皮细胞，流式细胞仪检测新鲜和冻存复苏后细胞HLA-ABC及HLA-DR抗原的表达，判断在模拟体内炎症环境中新鲜和冻存血管内皮细胞免疫原性的强弱。 结果： 1、人脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好，呈典型的铺路石样形态学表现，Ⅷ因子、CD31、CD34细胞免疫组化显示早阳性反应，及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力，从而鉴定为血管内皮细胞。 2、台盼蓝据染结果表明利用程序降温盒冻存复苏的细胞活性为88±5.3%，普通的梯度冻存复苏存活率为75.8±8.1%，与程序降温盒冻存细胞存活率有显著差别（P<0.05）。新鲜与深低温冻存的血管内皮细胞形态类似，生长增值情况良好，生长曲线类似，未见明显差别（P>0.05）。 3、单向混合淋巴细胞-血管内皮细胞培养；MTT结果显示新鲜组血管内皮细胞对人外周血淋巴细胞刺激指数为1.716±0.181，冻存组血管内皮细胞对人外周血淋巴细胞刺激指数为1.686±0.145，两者对外周血淋巴细胞刺激无显著差别（P>0.05）。 4、新鲜和深低温冻存复苏的脐静脉血管内皮细胞均表达HLA-ABC抗原，而不表达HLA-DR抗原，HLA-ABC抗原表达率（96.55±1.88 vs95.98±1.4）和平均表达强度（84.13±5.73 vs82.36±4.75）均未见明显差别（P>0.05）； 5、通过不同浓度IFN-γ诱导培养后，HLA-ABC抗原的平均表达强度增强，HLA-DR抗原的平均表达强度和表达率逐渐加强，且呈剂量依赖性，HLA-ABC抗原平均表达强度新鲜组和冻存组未见明显差别，但新鲜组中HLA-DR抗原的表达率和平均表达强度均高于冻存组（P<0.01）。 结论： 1、通过本研究，建立了一整套的人脐静脉血管内皮细胞原代分离、培养、传代及冻存复苏方法，并通过鉴定，可以初步构建脐静脉血管内皮细胞库，为血管内皮细胞的研究提供平台。 2、在无或低（IFN-γ≤50u/ml）免疫炎症环境下，深低温冻存复苏2周前后的HUVEC免疫原性与新鲜细胞比较无显著变化。 3.而在高（IFN-γ≥100u/ml）免疫炎症反应条件下，经过深低温冻存复苏的HUVEC中 HLA-DR抗原表达显著低于新鲜细胞，这可能是冷冻细胞降低其免疫原性的机制。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分：人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)原代培养

前言

1 材料与方法

2 结果

附图

第二部分：深低温冻存复苏对HUVEC免疫原性影响的实验研究

前言

1、材料与方法

3、结果

分析与讨论

全文小结

参考文献

附录 校期间发表的文章

致谢

综述 深低温保存与组织免疫原性