紫杉醇体外诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞凋亡及其分子机制研究

摘要

目的： 1．探讨紫杉醇的不同药物浓度、作用时限与大鼠C6脑胶质瘤细胞凋亡过程的关系，建立紫杉醇诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞株凋亡的细胞研究模型。 2．分析大鼠C6脑胶质瘤细胞在紫杉醇不同时限作用后，细胞抑制率、细胞周期和细胞凋亡相关的热点分子Bcl-2家族BH3-only蛋白Puma、Noxa、Bim的mRNA水平的表达变化，以及BH3-only蛋白与p53 mRNA水平表达相互之间的关系，初步探讨紫杉醇诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞凋亡的机制。 方法： 1．细胞培养及药物浓度和作用时限的确定：大鼠C6脑胶质瘤细胞株KG-099的维持及扩大培养；用台盼蓝染色后检测KG-099细胞活率，并选择细胞活率在90%以上进行传代培养：MTT法检测紫杉醇对细胞的增殖抑制作用，并选择合适的药物浓度进行下一步实验。 2．细胞凋亡的观察：荧光倒置显微镜下观察0．1μmol/L紫杉醇作用C6脑胶质瘤细胞后，不同时间点（4、8、16、24、48h）细胞生长情况和细胞形态学改变；选取对数生长期的C6脑胶质瘤细胞用0．1μmol/L紫杉醇以不同时间点（4、8、16、24、48h）进行诱导，用流式细胞仪检测细胞周期的变化。 3．细胞凋亡机制的研究：SYBR Green Real-Time RT-PCR法检测0．1μmol/L紫杉醇的不同时间点（4、8、16、24、48h）作用C6脑胶质瘤细胞后Puma、Noxa、Bim、p53的mRNA水平的表达。 4．分析上述指标在细胞凋亡过程中的变化及其相互关系。 结果： 1．紫杉醇对大鼠C6脑胶质瘤细胞具有明显增殖抑制作用，随紫杉醇浓度的增加细胞抑制率逐渐升高，48h细胞IC50约为0．1μmol/L；细胞抑制率随紫杉醇作用时间的延长逐渐升高，48h细胞抑制率为51．73%。 2．紫杉醇诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞后生长情况和形态学变化：细胞从贴壁好、生长密集、折光性好向贴壁少，细胞收缩体积变小，数目减少、折光性差，出现坏死崩解细胞改变，个别细胞可见到核碎裂，呈凋亡形态学改变。 3．紫杉醇诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞后细胞凋亡的分析：流式细胞仪检测细胞周期发现，随着紫杉醇诱导时间的延长，G2/M期细胞逐渐增加，S期细胞逐渐减少；0．1μmol/L紫杉醇作用大鼠C6脑胶质瘤细胞后24h检测到明显凋亡峰，凋亡率为11．34%。 4．紫杉醇诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞后凋亡信号转导分子Puma、Noxa、Bim、p53的mRNA水平的表达：SYBR Green Real-Time RT-PCR法检测发现，大鼠C6脑胶质瘤细胞中Puma、Noxa、Bim和p53 mRNA均可表达；在紫杉醇诱导下，Puma、Noxa和p53 mRNA表达随诱导时间延长呈增高趋势，Bim mRNA表达并不受紫杉醇诱导影响。 结论： 1．紫杉醇对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈剂量、时间依赖性。 2．紫杉醇可诱导脑胶质瘤细胞的凋亡；同时可使大鼠C6脑胶质瘤细胞阻滞在G2/M期，减少进入S期的细胞数。 3．紫杉醇主要通过激活p53和其随后转录激活BH3-only蛋白Noxa、Puma来诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引言

材料与方法

结果

分析和讨论

小结

参考文献

附录

个人信息

致谢

综述BH3-only细胞凋亡调节蛋白的研究进