姜黄素对SHR视网膜缺血再灌注后细胞凋亡及p53表达的影响

摘要

目的： 研究自发性高血压大鼠(SHR)视网膜缺血再灌注后细胞凋亡及p53的表达，并探讨姜黄素对其变化的影响。 方法： 制作大鼠视网膜缺血再灌注(retinal ischemia reperfusion，RIR)模型，将12周龄雄性SHR随机分为假手术组(SHR-SH)、缺血组(SHR-IR)、姜黄素预处理组(SHR-CU)，每组又分为再灌注后2、6、24、72 h和7d等五个亚组，以同周龄血压正常的雄性WKY大鼠分为同样组别作为对照。姜黄素预处理组剂量为100 mg/kg，均在缺血前1h腹腔给药。每亚组9只大鼠，分别制备大鼠视网膜石蜡切片、视网膜毛细血管铺片和活组织冰冻标本。用HE染色观察大鼠视网膜和视网膜毛细血管细胞形态学变化，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口翻译法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end-labeling， TUNEL)检测细胞凋亡，分光光度计法检测视网膜Caspase-3酶表达活性，兔疫组织化学过氧化物酶标记的链霉卵白素染色法(streptavidin-perosidase，SP)法检测再灌注后不同时段视网膜组织中p53蛋白表达变化。 结果： (1) HE染色：假手术组大鼠视网膜神经节细胞(RGC)呈单层整齐排列，数目较多，内核层(INL)由3-5层细胞构成，染色深；外核层(ONL)较厚，有8-10层细胞，排列紧密，染色深，缺血组再灌注6h后RGC和INL细胞出现排列紊乱，再灌注24 h后上述变化更加明显，视网膜略水肿，细胞排列疏松而紊乱，较多RGC呈空泡状改变，再灌注72 h后水肿减轻，再灌注7d后无明显水肿，可见RGC数目减少。缺血组各再灌注点视网膜变化比姜黄素预处理组明显。 视网膜毛细血管自然舒展，网状交织。内皮细胞核呈长椭圆形，位于毛细血管的中央或稍偏位，较周细胞核略大，周细胞核呈短椭圆形或圆形，多位于血管分岔处，稍凸出于血管壁，在SHR毛细血管铺片上尚可见少量无细胞毛细血管网，即管腔内无内皮细胞和周细胞，血管腔大小不均，管壁变形，偶见闭塞。WKY未见此现象。 (2) TUNEL染色：视网膜石蜡切片切片：SHR-SH有明显凋亡阳性染色，与WKY-SH比较差异有显著性(P<0.05)。SHR-IR凋亡细胞明显增加，以再灌注24 h组凋亡数最多，之后逐渐下降。视网膜RGC出现最多，INL次之，ONL也有少量阳性染色。WKY-IR比SHR-IR细胞凋亡数少，各对应缺血时间点之间比较均有统计学意义。WKY-IR与WKY-SH比较有统计学差异(P<0.05)。姜黄素能显著减少缺血再灌注损伤引起细胞凋亡，各时间点SHR-CU组视网膜凋亡细胞数分别是SHR-IR组的73.9％，74.0％，69.1％，74.9％，66.6％(P<0.05)； WKY-CU组凋亡细胞数分别是WKY-IR组的63.2％，78.7％，57.5％，68.8％，66.2％(P<0.05)。 视网膜毛细血管铺片的凋亡表现为：细胞核棕黄色深染，核膜完整，核中央染色稍浅，近核膜处着色较深，胞核多位于血管壁一侧。SHR-SH有明显凋亡现象，而WKY-SH毛细血管几乎无阳性染色，两组之间差异有显著性(P<0.05)。SHR-IR以再灌注24 h后凋亡最多，400倍镜下细胞凋亡百分率达20.72±2.98％，再灌注72h后次之，再灌注2h和7d凋亡较少，但仍较SHR-SH多。WKY-IR比SHR-IR细胞凋亡数少，各对应缺血时间点之间比较均有统计学意义(P<0.05)。在缺血再灌注各时间点，姜黄素预处理组视网膜毛细血管凋亡细胞数均少于对应的缺血再灌注组(P<0.05)。 (3)视网膜免疫组化：p53蛋白主要在细胞核表达，SHR-SH有少量p53蛋白表达，主要分布在RGC，但各时间点间无明显差异(P>0.05)，WKY-SH则无明显阳性染色，SHR-SH与WKY-SH比较有统计学差异(P<0.05)。SHR-IR组再灌注2h后p53表达开始增多，6h后表达继续上升，在INL和毛细血管表达增多，至24 h表达至高峰，再灌注72 h后p53蛋白表达开始下降，7d后表达明显减少，但与假手术组比较，差异仍有统计学意义(P<0.05)。WKY-IR也有上述p53蛋白表达变化曲线，但均少于相同时间点的SHR-IR(P<0.05)。姜黄素预处理组p53表达明显减少，各时间点平均光密度值SHR-CU组低于SHR-IR组(P<0.05)，WKY-CU组低于WKY-IR组(P<0.05)。 (4)视网膜Caspase-3酶活性：假手术组各时间点视网膜Caspase-3酶活性无明显差异，但SHR-SH组Caspase-3酶活性比WKY-SH组高，两组间有统计学差异(P<0.05)。在缺血再灌注组，SHR-IR在再灌注2、6、24和72 h该酶活性要高于SHR-SH组(P<0.05)，但在再灌注7d时两组间无统计学差异(P>0.05)。WKY-IR除7d这个时间点外，Caspase-3酶活性在其余各时间点均高于WKY-SH(P<0.05)。SHR-IR在各时间点的酶活性分别比对应的WKY-IR组高(P<0.05)，但比SHR-CU组低(P<0.05)，其中在7d时相当。姜黄素能降低WKY缺血再灌注后Caspase-3酶活性，在再灌注6h，24 h和72 h Caspase-3酶活性WKY-CU组分别较WKY-IR组降低9.3％，22.8％和18.0％(P<0.05)，在再灌注2h，7d两组比较无统计学意义(P>0.05)。 结论： 高血压状态下发生RIR损伤视网膜和视网膜毛细血管细胞凋亡显著增加，p53表达增强，且尤以缺血再灌注后24 h为著。姜黄素对RIR损伤有保护作用，调控凋亡相关基因p53蛋白的表达可能是其作用机制之一。

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综述 高血压和细胞凋亡