姜黄素对大鼠全脑缺血再灌注损伤诱导内质网应激的影响

摘要

目的:观察姜黄素对大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区GRP78、GADD153和Caspase-12表达及神经元凋亡的影响,阐明姜黄素对大鼠全脑缺血再灌注损伤诱导内质网应激的影响,进一步阐明姜黄素脑保护作用的分子机制,为该药临床应用提供实验基础和理论依据。
　　 方法:雄性SD大鼠144只,随机分成四组:假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、溶剂对照组(VC组)及姜黄素组(Cur组)。S组仅烧灼双侧椎动脉,游离双侧颈总动脉但不阻断；其余三组在烧灼双侧椎动脉、游离双侧颈总动脉24 h后,阻断双侧颈总动脉15 min,建立四血管闭塞全脑缺血模型,VC组大鼠在缺血前1 h腹腔注射羧甲基纤维素钠,Cur组大鼠在缺血前1 h腹腔注射姜黄素200 mg/kg;上述实验组在再灌注12 h、1 d、3 d、7 d四个时间点处死,并且上述四组再分为两个亚组:①各时间点多聚甲醛灌注固定大脑组织后,通过HE染色观察各时间点海马细胞形态改变、免疫组化观察GRP78、GADD153和Caspase-12的表达及DNA断端末端标记(TUNEL)法标记凋亡阳性细胞(n=6)；②各时间点大鼠急性断头处死,迅速冰上取海马组织液氮低温冰冻保存,裂解组织,提取目的蛋白,用免疫蛋白印迹法对GRP78、GADD153和Caspase-12进行半定量分析(n=3)。
　　 结果:
　　 1、形态学变化:与S组海马各区锥体细胞相比,VC组和IR组大鼠海马CA1区锥体细胞排列稀疏、胞浆浓缩、胞核固缩碎裂；Cur组在相应时间点与IR组病理变化规律基本一致,但损伤较轻。
　　 2、凋亡细胞计数:各实验组凋亡细胞主要集中在CA1区,再灌注12h出现少量凋亡细胞后逐渐增加,3 d达到高峰后减少,至7 d仍有少量凋亡细胞存在,IR组各时间点凋亡细胞数明显高于S组及Cur组(P<0.05)。
　　 3、GRP78、GADD153和Caspase-12表达的变化:
　　 A、免疫组化:GRP78在S组海马CA1区有少量表达；IR组海马CA1区GRP78的表达在再灌注12 h开始升高,至1d达峰值后逐渐下降。VC组和IR组各时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)；Cur组CA1区GRP78的表达情况和规律与IR组相似,但表达水平明显高于IR组(P<0.05)。GADD153在S组海马CA1区有少量表达；IR组海马CA1区GADD153的表达在再灌注12h开始升高,至3d达峰值后逐渐下降。VC组、IR组和Cur组各时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)。Caspase-12在S组海马CA1区有少量表达；IR组海马CA1区Caspase-12的表达在再灌注12h开始升高,至3d达峰值后逐渐下降。VC组和IR组各时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)；Cur组CA1区Caspase-12的表达情况和规律与IR组相似,但表达水平明显低于IR组(P<0.05)。
　　 B、免疫蛋白印迹:GRP78在S组海马有少量表达；IR组海马GRP78的表达在再灌注12 h开始升高,至1d达峰值后逐渐下降。VC组和IR组各时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)；Cur组GRP78的表达情况和规律与IR组相似,但表达水平明显高于IR组(P<0.05)。GADD153在8组海马有少量表达；IR组海马区GADD153的表达在再灌注12 h开始升高,至3d达峰值后渐下降。VC组、IR组和Cur组各时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)。Caspase-12在S组海马有少量表达；VC组于再灌注后12h表达明显升高,至再灌注3d达高峰后逐渐下降。Cur组Caspase-12的表达规律与IR组相似,但表达水平明显低于IR组(P<0.05)。VC组与IR组在各时间点的表达均无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论:姜黄素可显著减少SD大鼠缺血性海马神经元再灌注后凋亡的发生,其机制可能与内质网应激的参与有关,早期通过促进GRP78表达增加来减轻内质网蛋白负荷以保护细胞、抵抗缺血损伤,后期则通过减少Caspase-12表达从而减少细胞凋亡的发生。