创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达及血必净干预

摘要

目的:
　　 探讨创伤弧菌(Vv)脓毒症大鼠肺组织基质金属蛋白酶(MMP)2和9、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)1的动态表达及血必净干预。
　　 方法:
　　 1.清洁级SD大鼠110只,雌雄各半,随机分成11组,每组10只,雌雄各5只。1组:正常对照组(A组)。第2～6组:创伤弧菌脓毒症组(B组),予左侧下肢外侧皮下注射Vv悬浊液,浓度为6×108cfu/ml,剂量为0.1ml/100g,构建创伤弧菌脓毒症模型。该组大鼠分别在染菌后1h、6h、12h、24h、48h时活杀。第7～11组:Vv脓毒症血必净干预组(C组),予左侧下肢外侧皮下注射Vv悬浊液(浓度、剂量同B组)后0.5h始,予腹腔注射血必净4ml/kg,每12h一次,分别在染菌后1h、6h、12h、24h、48h时活杀。无菌操作取部分肺组织于液氮中保存待用。
　　 2.观察各组大鼠在体温、呼吸、心跳、精神状态等情况的改变,随机取B组各时间点大鼠1只,无菌取血送检血培养。
　　 3.RT-PCR法检测各组大鼠MMP2、MMP9、TIMP1的基因表达。琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像,Quanity One分析软件分析,以(目的基因10D值/β-actin10D值)为表达校正值进行比较。
　　 4.免疫组织化学法检测MMP9蛋白表达及组织分布:链霉素-辣根过氧化物酶(SP)法检测,每组随机取5张切片,每张切片随机取5个高倍视野,×400镜下拍照。
　　 5.ELISA法检测TIMP1蛋白表达:100mg左肺组织:1ml生理盐水组织匀浆,标本稀释倍数为1000,按说明书进行。
　　 6.病理观察:取材,固定,石蜡包埋,切片,HE染色、×200光镜下拍照。
　　 7.超微结构观察:取0.1cm×0.1cm×0.1cm肺组织,固定,包埋,切片,光镜定位,铀-铅双重染色,H7500型透射电镜观察拍照。
　　 8.统计学分析:计量资料采用均数±标准差表示((x)±s),采用SPSS17.0分析,进行单因素方差分析、t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.B组染菌3h始,大鼠开始出现呼吸急促、体温升高、注射下肢肿胀等症状,症状进行性加重,染菌后12h出现明显紫绀、下肢肿胀坏死、间断抽搐等；C组大鼠在药物干预后,上述症状发生较轻,注射下肢肿胀程度轻、无紫绀、无抽搐；B组12h、24h大鼠血培养可见创伤弧菌生长。
　　 2.A组大鼠肺组织MMP2mRNA表达较低(0.102±0.032),B组大鼠染菌后1h(0.198±0.066)、6h(0.344±0.108)、12h(0.254±0.092)、24h(0.182±0.044)表达明显升高(P<0.05),以染菌后6h为最高。C组6h(0.193±0.083)、12h(0.256±0.074)表达明显高于正常(P<0.05),高峰在12h。C组与相同时间点B组相比,染菌后6h表达明显降低(P<0.05)。
　　 3.A组大鼠肺组织MMP9mRNA表达极低C0.345±0.109),B组大鼠染菌后1h(0.846±0.162)、6h(1.230±0.377)、12h(0.847±0.144)、24h(0.613±0.143)表达与A组相比,明显升高(P<0.05),C组染菌后1h(0.603±0.085)、6h(0.968±0.225)表达明显高于A组(P<0.05)。两组表达趋势相似,高峰均在染菌后6h。C组与相同时间点B组相比,1h、6h、12h肺组织MMP9mNA表达降低明显(P<0.05)。
　　 4.A组大鼠肺组织MMP9蛋白表达量极低(0.011±0.005),B组大鼠染菌后6h(0.034±0.011)、12h(0.061±0.017)、24h(0.035±0.018)、48h(0.023±0.017)表达明显升高(P<0.05)。C组染菌后6h(0.034±0.009)、12h(0.045±0.013)、24h(0.026±0.014)、48h(0.021±0.008)表达高于正常(P<0.05)。两组表达趋势相似,高峰均在染菌后12h。C组与相同时间点B组相比,12h、24h表达降低明显(P<0.05)。
　　 5.A组大鼠肺组织TIMP1mRNA表达量极低(0.236±0.026),B组大鼠染菌后6h(0.427±0.189)、12h(0.523±0.098)、24h(0.463±0.117)表达明显升高(P<0.05),C组染菌后6h(0.618±0.301)、12h(0.746±0.316)、24h(0.534±0.193)表达明显升高(P<0.05)。两组表达趋势相似,高峰均在染菌后12h。C组与相同时间点B组相比,6h、12h表达升高明显(P<0.05)。
　　 6.A组大鼠肺组织TIMP1蛋白表达量低(629.30±110),B组大鼠染菌后12h(1141.09±117)、24h(1384.42±91)、48h(1271.90±173)表达明显升高(P<0.05)。C组染菌后6h(999.19±104)、12h(1189.68±266)、24h(1617.22±103)、48h(1280.36±118)表达高于正常(P<0.05)。两组表达趋势相似,高峰均在染菌后24h。C组与相同时间点B组相比,6h、24h表达升高明显(P<0.05)。
　　 结论:
　　 1.创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织MMP2、MMP9表达在脓毒症早期即达高峰,TIMP1于中晚期达高峰。
　　 2.使用血必净可减低创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织MMP2、MMP9表达、升高TIMP1基因表达,有利于机体损伤/修复平衡的恢复,改善创伤弧菌脓毒症肺损伤情况,有一定的保护作用。