脂多糖刺激单核巨噬细胞培养上清对成骨细胞成骨功能的影响

摘要

牙周炎是人类最常见的两大口腔疾病之一,常造成牙齿的松动和移位,因此需要通过正畸和牙周联合治疗以最大限度恢复口颌系统的正常功能和美观。目前临床上普遍认为处于静止期的牙周炎患者可以接受正畸治疗。然而对于牙周炎个体是否适宜接受正畸治疗以及该如何选择大小合适的矫治力以及加力频率等相关理论和临床知识知之甚少,因此如何才能实现此类患牙安全有效的正畸治疗已经成为正畸医生关注、并且急切需要解决的问题。
　　 然而在体外研究应力对于炎症牙周组织改建的影响首先需要在体外模拟牙周炎症状态。牙周病学的这方面研究为我们提供了思路。牙周炎是包括牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis,P.g)等革兰阴性厌氧菌感染引起的慢性炎症性疾病。这些致病菌外膜中主要结构成分之一的脂多糖(LPS),是最重要的牙周炎症启动因子之一,其可以刺激单核-巨噬细胞分泌白细胞介素(interlukin,IL)-1、6和8、TNF等多种炎性介质,从而在牙周炎的发生、发展中起重要作用。
　　 成骨细胞是骨形成和骨吸收的细胞学基础,其即是骨形成的效应细胞,同时又参与调控破骨细胞的分化与成熟,在骨代谢中起着重要调节作用。有研究表明牙槽骨丢失是骨吸收增加或骨形成降低或两者共同作用的结果,因此作为牙周组织靶细胞的成骨细胞在牙周炎的发生、发展中发挥重要的作用。
　　 因此本实验尝试和探索应用P.gingivalis LPS刺激单核巨噬细胞培养上清液建立类似于牙周炎症时的环境,并以此上清液作用于成骨细胞,从细胞及分子水平上观察不同浓度Pg-LPS刺激单核巨噬细胞培养上清液对成骨细胞生物学行为的效应,为体外建立牙周炎模型及进一步从细胞和分子水平探讨炎症状态下正畸力对牙周骨改建的影响奠定了基础。本论文由三部分组成:
　　 第一部分:Pg-LPS刺激RAW264.7表达TNF-α、IL-1β和IL-6的定量研究
　　 目的:定量研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis Pg)脂多糖(LPS)刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7表达IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。为后期在体外建立牙周炎症模型以及探讨应力对炎症状态下骨改建的影响奠定基础。
　　 方法：采用ELISA试剂盒定量检测不同浓度的Pg-LPS(1ng/ml,100ng/ml,10ug/ml)作用RAW264.7细胞6h,12h,24h和48h后分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
　　 结果：Pg-LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7可以产生炎性物质IL-1β、IL-6和TNF-α,且与Pg-LPS的浓度和刺激时间呈依赖性。以1ng/ml的LPS浓度刺激RAW264.7不同时间点后收集的上清中IL-1β、IL-6和TNF-α表达未见明显变化,当LPS浓度为100ng/ml时,IL-1β的释放量从25.71±10.89到70.36±2.32,IL-6的释放量从59.59±1.26到419.31±12.36,TNF-α的释放量从22.56±1.83到49.58±7.44。当LPS浓度为10μg/ml时,IL-1β的释放量从31.20±7.36到83.92±2.89,IL-6的释放量从65.70±1.54到486.62±17.35,TNF-α的释放量从30.12±1.45到113.93±8.39。
　　 结论：Pg-LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7可释放炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α,并呈现时间依赖性和浓度依赖性,与体内牙周炎症部位的环境具有一定的相似性。
　　 第二部分:Pg-LPS刺激RAW264.7的炎症上清对成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响
　　 目的:观察经牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞MC3T3一E1增殖和碱性磷酸酶活性的影响。
　　 方法：收集Pg-LPS刺激的RAW264.7培养上清,以不同稀释浓度(10％、20％、30％、40％和50％)的培养上清作用于成骨细胞MC3T3-E124h和48h后,分别通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性及碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测碱性磷酸酶活性,采用SPSS12.0进行统计学分析。
　　 结果：MC3T3-E1经不同稀释浓度的培养上清刺激后,MC3T3-E1增殖活性和ALP活性均受抑制,且与培养上清的浓度呈浓度依赖性。
　　 结论：Pg-LPS刺激的RAW264.7培养上清可抑制MC3T3-E1的增殖和碱性磷酸酶活性。
　　 第三部分:Pg-LPS刺激RAW264.7的炎症上清对成骨细胞OPG/RANKL,表达的影响
　　 目的:观察经牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞MC3T3-E1 OPG/RANKL表达的影响。
　　 方法：收集Pg-LPS刺激的RAW264.7培养上清,以不同稀释浓度(10％、20％、30％、40％和50％)的培养上清作用于MC3T3-E124h,用RT-PCR方法检测细胞OPGmRNA/RANKLmRNA表达的变化,用免疫印迹法(western Blotting)检测其蛋白表达的变化。
　　 结果：MC3T3-E1经不同稀释浓度的培养上清刺激后,其OPGmRNA及蛋白表达随浓度的增大而明显增加,而RANKLmRNA及蛋白表达随浓度的增大明显减少。
　　 结论：Pg-LPS刺激的RAW264.7培养上清内的炎症因子可抑制成骨细胞RANKLmRNA及蛋白的表达,增加OPGmRNA及蛋白的表达。