siRNA对α-2，6-唾液酸转移酶的下调作用及其增敏紫杉醇对乳腺癌细胞的凋亡诱导效应研究

摘要

目的：
　　 1、研究siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-435表面α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平的下调作用。
　　 2、研究乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,增敏紫杉醇对该细胞的凋亡诱导效应。
　　 3、研究乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,联合应用紫杉醇对该细胞与细胞外基质黏附作用的影响。
　　 方法：
　　 1、siRNA对α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平的下调作用。
　　 1)、构建低α-2,6-唾液酸转移酶乳腺癌细胞模型(即AS细胞):以ST6GalⅠ的siRNA沉默乳腺癌细胞MDA-MB-435 ST6 GalⅠ mRNA的表达,构建稳定的低a-2,6.唾液酸转移酶乳腺癌细胞模型；同时构建乳腺癌细胞空载体模型(即MOCK细胞)作为对照；
　　 2)、以RT-PCR检测MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞中ST6GalⅠ mRNA的表达水平；
　　 3)、以FITC-MAA、FITC-SNA、FITC-PNA标记MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞,用流式细胞仪检测各组细胞表面α-2,3-唾液酸、α-2,6-唾液酸和细胞表面总唾液酸的表达水平。
　　 2、乳腺癌细胞表面ST6GalⅠ水平下调后,对紫杉醇诱导该细胞凋亡的增敏效应。
　　 1)、紫杉醇对不同唾液酸化的乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞)的凋亡敏感性比较:以10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L三个浓度紫杉醇分别处理MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞,酶联免疫检测仪检测吸光度,进而筛选出紫杉醇诱导三组细胞凋亡的最佳浓度；
　　 2)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),台盼蓝染色显微镜下观察细胞形态,并计算紫杉醇作用下各组细胞的存活率；
　　 3)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),AnexinV-PI双染凋亡试剂盒标记,用流式细胞仪检测紫杉醇对其的诱导凋亡情况；
　　 4)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),用caspase-3试剂盒检测各组细胞中caspase-3酶活性,进而了解紫杉醇对其的诱导凋亡情况；
　　 5)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),用caspase-8试剂盒检测各组细胞中caspase-8酶活性,进而了解紫杉醇对其的诱导凋亡情况。
　　 3、乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,联合应用紫杉醇对该细胞与细胞外基质黏附作用的影响。
　　 1)、MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞与不同浓度的细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验,用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测黏附细胞数量差异,选择出用该两种细胞外基质进行黏附实验所需的最佳ECM含量；
　　 2)、用最佳的FN/CollagenⅣ量铺板,进行MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞与细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验,比较三组细胞间的黏附性差异,用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测黏附细胞数量差异；
　　 3)、联合应用紫杉醇后,用最佳的FN/CollagenⅣ量铺板,进行三组细胞与细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验,用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测黏附细胞数量差异。
　　 结果：
　　 1、RT-PCR检测MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞中ST6GalⅠmRNA的表达水平:母代细胞表达量最高,其次是MOCK细胞,AS细胞中ST6GalⅠ mRNA的表达水平最低。说明siRNA对α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平具有下调作用。
　　 2、流式细胞仪检测各组细胞表面唾液酸的表达水平:三组细胞中,以FITC-PNA和MAA抗体标记的表达水平无明显差异,但以FITC-SNA抗体标记的在AS细胞中表达水平明显下降。
　　 3、以10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L三个浓度紫杉醇分别处理三组细胞,筛选出紫杉醇诱导三组细胞凋亡的最佳浓度为:10-7mol/L。
　　 4、以10-7mol/L的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,用台盼蓝染色显微镜下细胞存活率计数结果显示:MDA-MB-435母代细胞形态尚可,包膜完整,胞质清亮,存活率约为82％；MOCK细胞胞体变大,变圆,部分细胞发生融合,存活率约为67％:AS细胞出现大量融合,细胞呈圆形,胞膜不规则,不完整,存活率仅为48％。
　　 5、以10-7mol/L的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,流式细胞仪检测结果显示:母代细胞凋亡百分率为9.1％,MOCK细胞凋亡百分率为17.3％,AS细胞凋亡百分率为30.2％。
　　 6、以10-7mol/L的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,caspase-3试剂盒检测结果显示:AS细胞中easpase-3酶活性最大,紫杉醇对其诱导凋亡作用最强；MOCK细胞和母代细胞中caspase-3酶活性明显低于AS细胞,两者之间差别不大。
　　 7、以10-7mol/L,的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,caspase-8试剂盒检测结果显示:AS细胞中caspase-8酶活性最大,紫杉醇对其诱导凋亡作用最强；MOCK细胞和母代细胞明显低于AS细胞。
　　 8、三组细胞与不同浓度的细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验结果显示:随着ECM含量的增加,发生黏附的细胞数量也增加,两者近似呈线性关系。母代细胞与细胞外基质的黏附性最强,MOCK细胞情况与其相仿,而AS细胞的黏附性最弱,同时,与FN黏附的细胞数量要高于与CollagenⅣ黏附组。选择出用该两种细胞外基质进行黏附实验所需的最佳ECM含量,即5μg/孔。
　　 9、用5pg/孔FN/CollagenⅣ铺板,三组细胞与它们黏附实验结果显示:母代细胞与细胞外基质的黏附性最强,MOCK细胞情况与其相仿,而AS细胞的黏附性最弱。其中铺FN组的黏附性要强于铺CollagenⅣ组。
　　 10、联合应用紫杉醇后,用5μg/孔FN/CollagenⅣ铺板,三组细胞与细胞外基质的黏附性显示:均较未用紫杉醇时黏附性降低,其中母代最强,MOCK细胞略低于母代细胞,而AS细胞的黏附性最弱。同样,铺FN组细胞的黏附性要强于铺CollagenⅣ组。
　　 结论：
　　 1、证实siRNA对α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平具有下调作用。
　　 2、乳腺癌细胞表面ST6GalⅠ水平下调后,可以增敏紫杉醇对该细胞的凋亡诱导效应。
　　 3、乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,联合应用紫杉醇可以进一步降低该细胞与细胞外基质黏附作用。