CFTR参与人类精子受精及其表达与精子质量相关

摘要

我们以前报道了囊性纤维化跨膜转导调节因子(Cystic FibrosisTransmembrane Conductance Regtnator,CFTR)是环磷酸腺苷(cAMP)激活的氯离子(Cl-)通道,参与调节小鼠和豚鼠精子获能及受精过程。已有研究报道CFTR基因突变可以导致精子质量下降。然而CFTR对人精子受精能力的影响,及其表达率与精子质量间的关系仍未确定。本次研究拟阐明一些因为不明性男性不育症,并可为男性不育症诊断提供新方法及开发男性避孕药提供新思路。
　　 目的:
　　 探讨CFTR对人类精子受精能力的影响及其表达率与精子质量间的关系。
　　 方法：
　　 1.为了阐明CFTR对人类精子受精能力的影响,我们采用以下方法进行了深入研究:
　　 1)在培养基内加入不同试剂(孕酮及CFTRinh-172)后进行精子获能培养5h,随后采用金霉素(Chlorotetracycline,CTC)荧光染色法,检测各组获能精子百分率(“B+AR”％),分析各组之间“B+AR”％是否存在显著差异性,从而评价CFTRinh-172对精子获能的影响。
　　 2)精子获能培养5h后,通过用环磷酸腺苷酶免疫法(EnzymeImmunoassay,EIA)来测定获能前后及不同组精子细胞内cAMP浓度,分析不同时间及不同组别之间cAMP浓度的差异性,进而评价CFTRinh-172对精子细胞内cAMP水平的影响,从另一角度来研究CFTR与人类精子获能间的关系。
　　 3)对于精子顶体反应评价,我们同样在培养基内加入不同试剂(rhZP3a及CFTRinh-172)后进行精子获能培养,采用CTC荧光染色法来检测各组精子顶体反应率(“AR”％),统计分析各组之间“AR”％是否存在显著差异性,从而分析CFTRinh-172对精子顶体反应的影响。
　　 4)将人精子与去透明带仓鼠卵子在不同试剂内(孕酮及CFTRinh-172)共同培养3h后,应用去透明带仓鼠卵精子穿透实验(SpermPenetration Assay,SPA)检测各组精子穿透率(精子穿透的卵子数/卵子总数×100％)及穿透指数(穿透卵子的精子总数/卵子总数×100％),比较各组之间是否存在差异,从而研究CFTRinh-172对精子受精能力的影响,尤其是对人精子体外精卵融合过程的影响。
　　 2.为了探讨CFTR在人类精子上的表达率与精子质量间的关系,我们将精液标本直接用PBS液洗三次之后,采用间接免疫荧光染色法检测CFTR在生育男性、健康男性及不育男性(主要包括畸形精子症、弱畸形精子症、弱精症及少精症)精子上的表达率,观察不同类型精子上CFTR表达率是否有显著差异性,进而探讨CFTR在人类精子上的表达率是否与精子质量相关。
　　 结果：
　　 1.精子获能培养后,P4组“B+AR”％明显高于对照组(P<0.01),表明P4促进精子获能；而CFTRinh-172各浓度组的“B+AR”％显著低于P4组(P<0.01),表明CFTRinh-172显著地抑制P4对精子获能的促进作用,且在10nM-1μM范围内呈浓度依赖性。
　　 2.获能培养5h后精子细胞内cAMP浓度明显比培养前要高(P<0.01),表明获能促进精子细胞内cAMP产生；而在100nM CFTRinh-172存在下,获能培养5h后精子内cAMP浓度明显低于5h对照组(P<0.01),说明CFTRinh-172降低获能精子细胞内cAMP水平。
　　 3.精子获能培养后,rhuZP3a组“AR”％显著高于对照组(P<0.01),表明rhuZP3a,诱导精子发生顶体反应；而CFTRinh-172各浓度组的“AR”％显著低于rhuZP3a.组(P<0.01),表明CFTRinh-172显著地抑制rhuZP3a对精子顶体反应的诱导作用,且在10hM-1μM范围内呈浓度依赖性。
　　 4.以卵内膨大的精子头和其相连的尾部存在,作为精子穿透指标。穿透率及穿透指数作为评价精子受精能力指标。与对照组及P4组相比,CFTRinh-172100nM组穿透率及穿透指数均明显下降(P<0.01),表明CFTRinh-172不仅抑制精子获能及顶体反应,还特异性的抑制精卵融合过程。
　　 5.间接免疫荧光染色法检测显示CFTR定位在人精子头部赤道板上,其在不同类型人精子上的表达存在显著差异:生育男性组CFTR表达率(87.9±3.9％)显著高于健康男性组(56.5±20.8％)及不育男性组(47.0±22.8～18.7±10.8％)(P<0.01)。表明CFTR在人类精子上的表达率与精子质量相关。
　　 结论：
　　 CFTR是人类精子受精所必须的,精子CFTR的表达率降低与精子质量下降相关,因此人类精子CFTR表达缺陷可能导致精子受精能力降低。