自噬相关候选蛋白的差异表达证和候选蛋白之一Hint2功能的初步探索

摘要

目的：
　　 自噬是真核细胞中的一种保守的代谢信号通路。目前已经知道自噬与肿瘤、感染、免疫、心血管疾病等密切相关，但自噬的分子机制仍不清楚。继续鉴定更多的自噬相关蛋白对于进一步阐明自噬的分子机制具有重要意义。本课题前期实验通过双向电泳结合串联质谱分析鉴定出了若干个细胞自噬前后表达量有差异的蛋白质，其中发现果糖二磷酸醛缩酶A(Fructose-1，6-bisphosphateAldolase，ALDOA)、组氨酸三聚体核苷结合蛋白2(Histidinetriadnucleotidebindingprotein2，HINT-2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase，GAPDH)和ATP合成酶O亚基(ATPsynthasesubunitO，ATP5O)四种蛋白的量在HeLa细胞发生自噬后表达量明显降低。因此本论文的主要目的是进一步验证这四种蛋白在自噬前后的表达差异，并根据其差异结果选择其中的线粒体蛋白HINT-2，作为研究自噬的靶蛋白，初步探索其在自噬过程中的功能。
　　 方法：
　　 1．通过Real-timequantitativePCR验证ALDOA，HINT-2，GAPDH和ATP5O四个蛋白在饥饿前后mRNA水平的表达量的差异；
　　 2.3-MA处理细胞再行饥饿，Real-timequantitativePCR检测四种候选蛋白mRNA水平的表达量；
　　 3．WesternBlot进一步验证HINT-2在不同自噬时相蛋白表达量的差异，初步选择HINT-2作为进一步研究的靶蛋白；
　　 4．克隆HINT-2基因，将其插入p3xFLAG-CMV-9质粒，构建真核表达载体p3xFLAG-HINT-2，并用酶切、菌落PCR及测序鉴定所构建的重组载体；
　　 5．用罗氏FuGENEHD转染试剂将质粒p3xFLAG-HINT-2及其对照空载质粒分别转染至HeLa细胞内，并以G418(1mg/ml)筛选稳定表达FLAG-HINT-2的细胞株FLAG-HINT-2-HeLa;
　　 6．以PCR检测Neo基因，并以WesternBlot法检测HINT-2蛋白表达水平，来验证筛选得到的过表达FLAG-HINT-2-HeLa细胞株；
　　 7．设计并合成三条HINT-2基因RNAi干扰片段，顺转至HeLa细胞，筛选沉默效果较好的片段，为后续构建稳定低表达细胞模型提供条件；
　　 8．为了给后续自噬相关的功能研究提供有利的细胞模型，我们用前期工作中已经构建的真核表达质粒peGFP-LC3转染HeLa细胞，并以G418筛选稳定表达GFP-LC3的GFP-LC3-HeLa细胞株；
　　 9．采用所获得的GFP-LC3-HeLa细胞株，以GFP标签的LC3表达变化情况作为指示，激光共聚焦下观察不同浓度（200nM，500nM，1uM）雷帕霉素(Rapamycin)作用不同时间(1hr，2hr，3hr，4hr)，HeLa细胞内荧光颗粒的亮度及大小，从而筛选雷帕霉素诱导自噬的最适条件。
　　 10.为了获得更多的自噬相关蛋白质信息，采用饥饿法（以HBSS代替培养基）诱导HeLa细胞产生自噬；用蔗糖梯度离心法粗提正常组与自噬组HeLa细胞线粒体蛋白；再通过双向电泳(pH3-10，NL)分离自噬组与正常组线粒体蛋白质，并用考马斯亮蓝染色；最后利用PDQuest软件分析双向图谱，筛选出表达有差异蛋白点。
　　 结果：
　　 1．前期双向电泳结合串联质谱实验结果显示：ALDOA,HINT-2GAPDH和ATP5O这四个候选蛋白在饥饿处理的HeLa细胞中表达量下降。为了进一步验证前期实验的结果，我们又设计了特异性引物，通过定量PCR检测这四种蛋白mRNA水平的表达差异，发现这四种蛋白的mRNA水平较未处理正常细胞明显下降；而以自噬抑制剂3-MA处理过的细胞在同样的饥饿条件下这几个基因的mRNA水平则与对照无差异。
　　 2．WesternBlot与Real-timequantitativePCR对HINT-2的验证结果表明：HINT-2的表达量在饥饿诱导细胞发生自噬时在mRNA水平与蛋白水平表达均下调。
　　 3．为进一步研究自噬相关线粒体蛋白HINT-2的功能，我们构建了真核表达载体p3xFLAG-HINT-2，经菌落PCR、酶切及测序鉴定证实载体构建成功。
　　 4．筛选了稳定表达FLAG-HINT-2的FLAG-HINT-2-HeLa细胞株，为后续研究HINT-2过表达状态下线粒体自噬打下了基础。
　　 5．筛选出两条沉默效果较好的HINT-2基因RNAi干扰片段，将为后续构建稳定低表达细胞模型提供有利条件。
　　 6．获得了稳定表达自噬标记蛋白GFP-LC3的GFP-LC3-HeLa细胞株，为自噬有关蛋白的功能研究提供了良好的实验模型细胞。
　　 7．以GFP-LC3-HeLa细胞为材料摸索了Rapamycin诱导自噬的最适条件，结果显示200uM的Rapamycin作用2hr后，GFP-LC3-HeLa细胞中已出现明显集中的自噬泡，表明此条件下即可获得明显的自噬效果。
　　 8．在利用双向电泳结合考马斯亮蓝染色进一步筛选自噬相关候选蛋白的实验中，我们的结果显示考马斯亮蓝染色得到的蛋白质点数少于银染结果，但二者得到的蛋白质点分布模式有些不同，因此提高蛋白上样量应当可得到一些不同于银染所得的差异自噬相关蛋白质。
　　 结论：
　　 双向电泳提示：饥饿诱导后的HeLa细胞内四种候选蛋白表达量较正常对照组下调均超过50％，而Real-timequantitativePCR验证发现四种候选自噬相关蛋白质ALDOA,GAPDH，ATP5O和HINT-2饥饿后在mRNA水平上表达较对照下降30％左右，这说明，这几种蛋白在蛋白质水平的变化至少部分是由于其转录水平发生了变化而引起的。
　　 由于饥饿导致的能量缺乏是引起自噬的重要原因，而线粒体是细胞能量代谢的主要细胞器，因此我们选定线粒体蛋白HINT-2作为进行进一步研究自噬发生机制的靶向蛋白。为此我们构建了真核表达载体p3xFLAG-HINT-2，并转染至HeLa细胞中，并以G418筛选出若干株稳定表达的FLAG-HINT-2-HeLa细胞株。经由Neo基因扩增和WesternBlot验证，获得了两株稳定过表达HINT-2的细胞。为了给自噬有关的机制研究提供有利的实验模型，我们建立了稳定表达自噬标记蛋白LC3并携带GFP标签的GFP-LC3-HeLa细胞株，且采用这个细胞摸索了另一种自噬诱导方法Rapamycin诱导的适宜条件。这些实验为后续进一步研究自噬有关的机理打下了良好基础。
　　 同时，为找到更多有意义的自噬相关候选蛋白，我们会改进提取线粒体的方法，并采用不同的双向电泳条件以及染色条件筛选差异蛋白质，从而为进一步了解自噬的机制提供线索。