多重耐药大肠埃希菌耐药基因与整合子相关性研究

摘要

目的：
　　 1、对多重耐药大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)临床株β-内酰胺酶类(β-lactamases，BLs)和氨基糖苷钝化酶类(aminoglycosidemodifyingenzymes，AMEs)耐药基因与Ⅰ-Ⅲ类整合子遗传标记基因之间的相关性进行研究；
　　 2、对多重耐药大肠埃希菌临床株16SrRNA甲基化酶的基因特征与接合传递效率进行研究，并探讨其与整合子之间的相关性；
　　 3、分析多重耐药大肠埃希菌耐药质粒谱，确立耐药基因在质粒上的座位。
　　 方法：
　　 1、采用VITEK-GNS药敏卡测定136株多重耐药大肠埃希菌对14种抗菌素的敏感性；纸片扩散法确认超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumbeta-lactamases，ESBLs)产酶株；PCR法检测BLs、AMEs相关耐药基因及Ⅰ-Ⅲ类整合子遗传标记基因。
　　 2、采用PCR法筛检136株多重耐药大肠埃希菌16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD;对阳性菌株作整合酶基因int1、int2和int3检测，并扩增Ⅰ类整合子可变区插入片段，对扩增产物进行测序与鉴定所含耐药基因盒；以阳性菌株为供体菌，耐叠氮化钠大肠埃希菌J53为受体菌进行接合试验，并结合质粒图谱对16SrRNA甲基化酶基因进行初步定位；琼脂稀释法测定136株多重耐药大肠埃希菌株与接合子的MIC值。
　　 3、采用PCR法检测BLs和AMEs相关耐药基因；质粒小量提取试剂盒提取质粒；低浓度琼脂糖凝胶电泳检测细菌质粒特征；以标准λDNA经HindⅢ酶切后的片段（其分子量分别为23.1，9.4，6.6，4.4，2.3，2.0kb）的电泳结果为标准系统，建立回归方程，换算出质粒DNA分子量。
　　 结果：
　　 1、136株E.coli呈现多重耐药性，其中，除对AMP和TOB100％耐药以外，对其他12种抗生素的耐药率由高到低依次为：GEN99.26％、SXT90.44％、LVX89.70％、CIP88.24％、CFZ82.35％、ATM79.41％、CRO78.68％、SAM76.47％、CAZ69.85％、AMK28.67％、TZP7.35％和IPM0.74％。136株多重耐药的EcoliESBLs产生率高达70.59％(96/136)，产酶株对氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素、亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦以外的其余9种抗菌素的耐药率显著高于非产酶株(P＜0.05)。BLs耐药基因总检出率为96.32％(131/136)，1株外膜通道蛋白oprD2基因缺失，AMEs耐药基因总检出率为100％(136/136)，Ⅰ类整合子遗传标记基因qacE△1-sul1的检出率为94.12％(128/136)，未检出Ⅱ类与Ⅲ类整合子基因。BLs基因和AMEs基因与qacE△1-sull遗传标记基因的同时携带率分别为90.44％(123/136)和94.12％(128/136)，两类同时携带率之间的差异不具统计学意义(P＞0.05)，上述两类耐药基因与qacE△1-sull遗传标记基因的三者同时携带率为90.44％(123/136)。
　　 2、在136株多重耐药E.coli中，共检出16SrRNA甲基化酶阳性菌12株(8.8％)，其中，armA阳性3株(2.2％)，rmtB阳性10株(7.4％)，未检出rmtA、rmtC、rmtD基因。阳性菌株均只含Ⅰ类整合子，对其可变区扩增片段(1000～2300bp)的测序结果显示，该区域含有多种耐药基因盒，但不含16SrRNA甲基化酶基因。接合试验与质粒图谱结果初步表明armA和rmtB编码基因位于约23kb的质粒上，接合试验的耐药质粒传递率高达83.3％(10/12)。
　　 3、136株多重耐药E.coli含52类不同谱型的质粒群，其中，1型的菌株最多，有18株，约占13.5％；质粒数目为1～9条，质粒片段大小在0.3×103bp～99.8×103bp之间，其中，较大质粒(23.1kb)出现率高达86.5％(117/136)。
　　 结论：
　　 136株多重耐药E.coli临床株多重耐药性的形成在BLs基因、AMEs基因与gacE△l-sull遗传标记基因三者之间有密切的相关性，而与Ⅱ和Ⅲ类整合子无关。初步证明armA和rmtB编码基因位于约23kb的质粒上，其中，rmtB为优势基因，接合试验和质粒图谱证明该类耐药质粒很容易在同种菌间传播。Ⅰ类整合子与16SrRNA甲基化酶基因虽然存在于同一菌体内和/或同处于一个质粒上，但整合子基因盒对该类基因的捕获率很低或根本不捕获。质粒谱中，某些分子量相同或相近的较大质粒能稳定的存在于细菌体内，介导耐药基因的传播与扩散。