miR-199a在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变中的表达及意义

摘要

目的：
　　 分析miR-199a在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变(CervicalIntraepithelialNeoplasia，CIN)中的表达情况及与宫颈癌各种临床病理特征的关系，探讨miR-199a与宫颈癌发生、发展的关系，为寻找宫颈癌治疗新靶点和预后指标奠定基础。
　　 方法：
　　 1．标本收集：选取2009年1月～2009年9月在温州医学院附属第一医院及温州市第二人民医院行手术治疗的宫颈鳞癌患者48例。患者年龄31～72岁，中位年龄49.6岁。肿瘤直径＜4cm19例，≥4cm29例。肿瘤类型：外生型19例，内生型15例，溃疡型10例，颈管型4例。病理分级：G110例，G214例，G324例。临床分期：按国际妇产科联盟(FIGO)的分期标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期14例。行宫颈电环切术(LoopElectrosurgicalExcisionalProcedure，LEEP)的CIN患者12例及行子宫肌瘤手术的正常宫颈组织20例。所有标本术后均经病理确诊。
　　 2．mir-199a-5p和mir-199a-3p表达分析：每例标本总RNA提取后，以mir-199a-5p和mir-199a-3p茎环逆转录引物进行逆转录。以U6作为内参，采用茎环RealtimeRT-PCR方法检测宫颈癌、CIN及正常宫颈组织miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达。
　　 3．miR-199a前体、Drosha、Dicer的RT-PCR检测：RNA标本，以oligodT及miR-199a前体(pri-miR-199a)特异RT引物为逆转录引物进行逆转录后。PCR扩增目的基因，以2％琼脂糖凝胶电泳分析结果。
　　 4．统计学分析：由于miR-199a-5p和mir-199a-3p的表达数据呈非正态分布，故以中位数和四分位数间距表示。采用SPSS16.0统计软件的非参数秩和检验进行统计处理。两组间差异分析采用Mann-WhitneyU检验，三组及以上差异表达分析采用Kruskal-WallisH检验，取P＜0.05为假设检验有统计学意义的标准。
　　 结果：
　　 1．用茎环RealtimeRT-PCR方法检测miR-199a-5p和miR-199a-3p表达的敏感性和特异性良好。
　　 2．以U6为内参，宫颈鳞癌组织中miR-199a-5p和miR-199a-3p的相对表达量(N=2-ACt)分别为0.68(0.43，1.97)和2.91(1.90，6.55)，CIN组织分别为0.87(0.56，1.94)和3.87(1.99，7.26)，正常宫颈组织分别为2.80(1.75，4.43)和12.92(6.23，17.95)。采用非参数秩和检验，miR-199a-5p和miR-199a-3p在宫颈癌及CIN组织中的表达低于正常宫颈组织，差异性显著(P＜0.05)，而宫颈鳞癌与CIN组织的miR-199a-5p和miR-199a-3p表达差异无显著性(P值分别为0.566和0.679)，提示同一前体起源的miR-199a-5p与miR-199a-3p在从正常宫颈向CIN及宫颈癌转变过程中表达下调。
　　 3．miR-199a-5p/miR-199a-3p表达比值在宫颈癌、CIN及正常宫颈组织分别为0.25(0.22，0.28)、0.26(0.22，0.30)及0.24(0.21，0.27)，差异无统计学意义(P=0.219)。
　　 4．Drosha、Dicer及miR-199a前体转录本在宫颈癌、CIN及正常宫颈组织的表达分析显示，与正常宫颈组织比较，CIN及宫颈癌组织的Dicer表达在RNA水平未见显著差异，Drosha及/或miR-199a前体转录本表达下降，但有宫颈癌标本的Drosha、Dicer及miR-199a前体转录本的表达与正常宫颈组织未见显著差异。
　　 5．miR-199a-5p表达与宫颈癌临床病理因素分析显示，miR-199a-5p的表达与宫颈癌的组织分化程度存在一定相关性。小细胞型(G3)宫颈癌的miR-199a-5p表达低于其他组织分化类型的标本(P=0.054))。miR-199a-5p在G1高分化鳞癌(角化性大细胞型)，G2中分化鳞癌(非角化性大细胞型)，G3低分化鳞癌(小细胞型)分别的表达为0.76(0.58，2.88)，0.85(0.64，1.97)，0.55(0.38，1.44)。miR-199a-5p的表达与年龄、肿块大小、大体类型及FIGO分期未见显著相关性(P＞0.05)。
　　 6．miR-199a-3p表达与宫颈癌临床病理因素分析显示，miR-199a-3p的表达与组织分化程度、年龄、肿块大小、大体类型、病理类型及FIGO分期均未见显著相关性(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1．miR-199a-3p和miR-199a-5p在宫颈癌及CIN组织中的表达显著低于正常宫颈组织，提示同-前体起源的miR-199a-5p与miR-199a-3p参与正常宫颈向CIN及宫颈癌转变过程。
　　 2．Drosha及/或miR-199a前体转录本表达下降可能是miR-199a-3p和miR-199a-5p在宫颈癌及CIN组织中的下调表达的原因之一。
　　 3．miR-199a-5p在小细胞型(G3)宫颈癌的表达低于其他组织分化类型的标本，提示miR-199a-5p的表达与肿瘤的分化程度存在一定相关性。
　　 4．miR-199a在宫颈癌组织中的异常表达，可能在宫颈癌的发生和发展过程中发挥重要作用，有望成为宫颈癌新的治疗靶点。