NRF2基因启动子-617C/A多态性对脂多糖刺激下小鼠巨噬细胞炎症反应的影响

摘要

目的：探讨人NRF2基因启动子-617C/A多态性的功能，观察其对脂多糖刺激下小鼠巨噬细胞炎症反应的影响。
　　 方法：
　　 第一部分人NRF2基因启动子-617C/A多态调控效率的检测
　　 1．合成NRF2617C及NRF2617A启动子，将上述两段序列装载至pUC57-Simple载体上。通过PCR鉴定，酶切鉴定，载体序列，序列比对分析鉴定pUC57-Simple-NRF2617Cp克隆为正确克隆。
　　 2．构建pGL3-Basic-NRF2617C及pGL3-Basic-NRF2617A，酶切鉴定pGL3-Basic-NRF2617C及pGL3-Basic-NRF2617A。
　　 3．将pGL3-Basic-NRF2617C、pGL3-Basic-NRF2617A进行大提。
　　 4．将293细胞接种于96孔板，共分4组：空启动子对照组；强启动子对照组；617C组和617A组，将构建好的各组质粒分别转染相应组别的293T细胞。
　　 5．双荧光素酶检测各组的发光值。
　　 第二部分Nrf2基因启动子-617C/A多态性对脂多糖刺激下小鼠巨噬细胞炎症反应的影响
　　 一.过表达NRF2基因腺病毒载体的构建
　　 1．穿梭载体pYr-adshuttle-1-NRF2的构建及鉴定，将NRF2617Cp及NRF2617Ap构建至pYr-ads-1-NRF2上。
　　 2．通过LR体外同源重组将各表达框构建至pAd/BL-DEST腺病毒表达载体上。
　　 3．准备进行转染的线性化腺病毒DNA，将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293。
　　 4．将上步的裂解上清感染HEK293，放大培养重组腺病毒。
　　 二．过表达NRF2基因腺病毒载体验证
　　 1．将RAW264.7细胞接种于96孔板，共分4组：空白细胞组；NC组(感染rAd-EGFP)；617C组(感染rAd-NRF2617Cp-NRF2):617A组（感染rAd-NRF2617CA-NRF2），将构建好的重组腺病毒分别转染相应组别的细胞，48h后收集细胞。
　　 2．通过RT-PCR测各组细胞Nrf2基因的相对表达量，WestonBlot测各组细胞Nrf2蛋白的表达。
　　 三．NRF2基因启动子-617C/A多态对脂多糖刺激下小鼠巨噬细胞炎症反应的影响
　　 1．将RAW246.7细胞接种于96孔板，共分4组：空白细胞组；NC组(感染rAd-EGFP)；617C组(感染rAd-NRF2617Cp-NRF2)；617A组（感染rAd-NRF2617CA-NRF2），将构建好的重组腺病毒分别转染相应组别的细胞，48h后加LPS(终浓度10mg/L)刺激，在37℃、5％C02条件下培养3小时，设置一组不加LPS刺激的空白细胞组，作为空对照。
　　 2．通过ELISA观察NRF2多态性基因表达对脂多糖引起的小鼠巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α表达的干预作用。
　　 结果：
　　 1．合成NRF2617C及NRF2617A启动子长度均为861bp:将上述两段序列装载至pUC57-Simple载体上并送交酶切及测序，无碱基发生突变、丢失和增加；pGL3-Basic-NRF2617C及pGL3-Basic-NRF2617A构建成功；双荧光素酶检测显示：与阴性对照组（pGL3-Basic组）比较，-617C组、-617A组调控效率偏高；与阳性对照组（pGL3-Control组）比较，-617C组、-617A组调控效率偏低；其中617C组的调控效率为617A组的1.74倍，-617C组调控效率与-617A组有显著差异性(P＜0.05)。
　　 2．pAd-NRF2、pAd-NRF2617Cp-NRF2、pAd-NRF2617Ap-NRF2构建成功；细胞实验结果：与空白细胞组和NC组比较，-617C组和-617A组NRF2的基因和蛋白的表达均明显偏高（P＜0.05），且-617C组NRF2基因和蛋白的表达明显低于-617A组（P＜0.05）。脂多糖刺激下，-617C组IL-6/IL-10比值较-617A组低(P＜0.05)且更接近空白细胞组(P＜0.05)；-617C组TNF-α/IL-10比值略高于-617A组，更接近空白细胞组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 NRF2基因启动子-617C/A多态具有功能性，调节着NRF2蛋白的表达水平；并能影响脂多糖刺激下巨噬细胞的抗炎因子水平。