创伤弧菌脓毒症大鼠血清NSE、S-100β及脑组织TSPO表达的变化及头孢哌酮钠联合左氧氟沙星的干预

摘要

目的：
　　 观察创伤弧菌脓毒症大鼠血清NSE、S-100β及脑组织TSPO基因及蛋白和促/抗炎因子(TNF-α、IL-6/IL-10)基因及蛋白的表达，并观察头孢哌酮钠联合左氧氟沙星对其的干预效果。
　　 方法：
　　 1．清洁级SD大鼠100只，雌雄各半，体重为180～260g，根据随机数字表将大鼠分为正常组(n=10，A组)，脓毒症模型组(n=40，B组)，抗菌药物干预组(n=40，C组)，抗菌药物对照组(n=10，D组)，B组和C组大鼠左后肢皮下注射创伤弧菌悬液(浓度为6×108cfu/ml，剂量为0.1ml/100g)。C组大鼠于染菌后2小时腹腔注射头孢哌酮钠180mg/kg和左氧氟沙星(18mg/kg)注射液，每日2次。B组与C组分别在注射创伤弧菌后6h、12h、24h、48h时活杀，各时相点动物数均为10只。
　　 2．采用RT-PCR法检测TSPO、IL-6、IL-10、TNF-αmRNA的表达量，采用Westernblot法测定TSPO的蛋白表达量，采用ELISA法测定各组大鼠血清中NSE、S-100β的蛋白表达量，采用ELISA法测定各组大鼠脑组织IL-6、IL-10、TNF-α蛋白的含量。
　　 3．观察各组大鼠在染菌及抗菌药物干预后行为学改变、脑组织病理、脑组织TSPO免疫组化及脑组织超微结构，并随机取B组各个时间点大鼠1只，取全血予血常规培养创伤弧菌。
　　 4．实验资料采用均数±标准差((?)±s)表示，应用SPSS13.0进行处理组间比较采用方差分析，各组两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有显著性意义。
　　 结果：
　　 1．大鼠染菌3h后出现活动减少，进食饮水减少，6h后皮温升高，肢端及口唇发绀明显，精神萎靡，偶有嘴角抽搐，反应明显变慢，呼吸急促，竖毛现象，随着时间的推延，左后肢肿胀明显，远端暗紫色，不能承力，嘴角及四肢抽搐频繁，前述症状加重，24h血培养创伤弧菌均为阳性。经头孢哌酮钠联合左氧氟沙星注射液干预后，大鼠出现类似脓毒症组的表现，但是时间延迟且症状有所减轻，正常大鼠无发热，活泼自如，呼吸平稳，进食正常，无下肢肿胀。
　　 2．A组大鼠脑组织TSPOmRNA的表达量0.147±0，105，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48h脑组织TSPOmRNA表达量分别0.380±0.294、0.551±0.152、0.934±0.121、0.616±0.233，与A组比较，均明显增高(P＜0.05)：C组24h脑组织TSPOmRNA表达量0.209±0.215，与B组相应时间点比较，明显减少(P＜0.05)；D组大鼠脑组织TSPOmRNA表达量0.187±0.179，与A组比较无明显差别(P＞0.05)。
　　 3．A组大鼠脑组织TSPO的蛋白表达量0.408±0.134，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48h脑组织TSPO表达量分别为1.151±0.188、1.459±0.156、1.750±0.208、1.442±0.156，与A组比较，均明显增加(P＜0.05)：C组24h脑组织TSPO蛋白表达量0.839±0.187，与B组相应时间点比较，明显减少(P＜0.05)；D组大鼠脑组织TSPO蛋白表达量0.416±0.150，与A组比较，无明显差别(P＞0.05)。
　　 4．A组大鼠脑组织IL-6mRNA的表达量0.40±0.26，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48h脑组织IL-6mRNA表达量分别为1.05±0.18、1.54±0.56、1.36±0.44、1.22±0.20，与A组比较，均明显增高(P＜0.05)；，C组12h脑组织IL-6mRNA表达量1.11±0.47，与B组相同时间点比较，明显减少(P＜0.05)，D组大鼠脑组织IL-6mRNA表达量0.33±0.16，与A组比较无明显差别(P＞0.05)。
　　 5．A组大鼠脑组织IL-6蛋白表达量41.35±2.42，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48h脑组织IL-6蛋白表达量分别为82.72±5.90、109.97±9.34、97.56±6.85、89.86±8.70，与A组比较，均明显增加(P＜0.05)，C组24h脑组织IL-6蛋白表达量61.73±2.12，与B组相同时间点比较，明显降低(P＜0.05)；D组大鼠脑组织IL-6蛋白表达量40.76±3.03，与A组比较，无明显差别(P＞0.05)。
　　 6．A组大鼠脑组织TNF-αmRNA的表达量0.41±0.23，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48h脑组织TNF-αmRNA表达量分别为1.75±0.21、1.44±0.16、1.46±0.16、1.51±0.19，与A组比较，均明显增高(P＜0.05)：C组6h脑组织TNF-αmRNA表达量1.14±0.88，与B组相同时间点比较，明显减少(P＜0.05)；D组大鼠脑组织TNF-αmRNA表达量0.46±0.37，与A组比较.无明显差别(P＞0.05)。
　　 7．A组大鼠脑组织TNF-α的蛋白表达量112.25±4.43，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48脑组织TNF-α蛋白表达量分别为231.42±10.44、192.03±5.49、172.34±9.39、164.33±4.75，与A组比较，均明显增加(P＜0.05)：C组6h脑组织TNF-α蛋白表达量203.59±4.53，与B组相同时间点比较，明显降低(P＜0.05)；D组大鼠脑组织TNF-α蛋白表达量108.55±5.44，与A组比较，无明显差别(P＞0.05)。
　　 8．A组大鼠脑组织IL-10mRNA的表达量(0.40±0.17)：C组抗菌药物干预后6h、12h、24h、48h脑组织IL-10mRNA表达量分别为1.01±0.79、1.27±0.23、1.51±0.19、1.71±0.23，与A组比较，均明显增高(P＜0.05)；B组48h脑组织IL-10mRNA表达量0.57±0.13，与C组相同时间点比较，明显减少(P＜0.05)，D大鼠脑组织IL-10mRNA表达量0.46±0.37，与A组比较，无明显差别(P＞0.05)。
　　 9．A组大鼠脑组织IL-10的蛋白表达量22.20±1，49，C组抗菌药物干预后6h、12h、24h、48hIL-10蛋白表达量分别为57.26±3.96、70.96±2.74、78.89±8.50、95.24±4.56，与A组比较，均明显增加(P＜0.05)；B组48h脑组织IL-10蛋白表达量50.43±2.20，与C组相同时间点比较，明显降低(P＜0.05)；D组脑组织IL-10蛋白表达量23.60±2.40，与A组比较，无明显差别(P＞0.05)。
　　 10．A组大鼠血清NSE蛋白表达量1.48±0.43，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48h血清NSE蛋白分别为6.64±0.53、8.44±0.35、20.87±1.36、13.46±3.88，与A组比较，明显增加(P＜0.05)；C组24h血清NSE蛋白含量3.57±0.32，与B组相应时间点比较，明显减少(P＜0.05)：D组血清NSE蛋白表达量2.71±0.48，与A组比较，无明显差别(P＞0.05)。
　　 11．A组大鼠脑血清S-100β蛋白表达量83.57±18.07，B组创伤弧菌感染后6h、12h、24h、48h血清S-100β蛋白表达量分别为535.49±50.18、1158.97±95.27、3874.47±157.77、1709.93±372.06，与A组比较，均明显增加(P＜0.05)：C组24h血清S-100β蛋白表达量120.22±15.42，与B组相同时间点比较，明显降低(P＜0.05)；D组血清S-100β蛋白表达量79.97±23.49，与A组比较，无明显差别(P＞0.05)。
　　 12．镜下观察A组脑组织形态正常，脑区染色均匀，神经细胞呈颗粒状，锥体状；D组与A组比较差别不大。在感染创伤弧菌后24h，B组与A组比较脑组织间质水肿严重，组织结构紊乱，染色淡，炎症细胞浸润，部分血管扩张，C组间质水肿减轻，脑组织结构紊乱减少，炎症及细胞浸润程度降低。
　　 13．镜下观察TSPO免疫组化结果，A组脑组织未见明显棕色颗粒；D组与A组比较差别不大。在感染创伤弧菌后24h，B组与A组比较棕灰色颗粒明显较多，C组棕灰色颗粒较B组明显减少。
　　 14.透射电镜下大鼠脑组织超微结构，A组脑组织神经元细胞核形态正常，较大，偏位，常染色体多，胞浆内有分泌颗粒，游离核糖体，粗面内质网及溶酶体，D组与A组比较无明显差别。感染创伤弧菌后24h，B组与A组比较神经元细胞核溶解消失，核内及胞浆间质水肿明显，游离核糖体显著减少，线粒体消失，粗面内网扩张明显，整个细胞密度稀疏；C组神经元细胞核变形，部分溶解，但形态尚存，细胞水肿及胞浆内细胞器的损伤程度较B组减轻，整个细胞密度较B组高。
　　 结论：
　　 1．创伤弧菌脓毒症大鼠血清NSE、S-100β及脑组织TSPO明显升高，敏感的反应脑损伤的程度，其升高与脑组织中的炎症反应密切相关。
　　 2．应用敏感抗菌药物头孢哌酮钠和左氧氟沙星干预治疗后能明显抑制炎症反应，减轻创伤弧菌脓毒症大鼠脑损伤，降低机体NSE、S-100β及TSPO的水平。