cAMP调节人巩膜成纤维细胞胶原合成的研究

摘要

目的：研究环磷酸腺苷cAMP调控体外培养的人巩膜成纤维细胞(humanscleralfibroblasts，HSF)胶原合成及其信号通路。
　　 方法：体外培养HSF，取5～8代的细胞，MTS法检测药物对HSF细胞增殖的影响；cAMPFluorescentAssayKit检测腺苷酸环化酶AC激活剂Forskolin/cAMP类似物db-cAMP刺激HSF后细胞内cAMP的含量；SircolCollagenAssayKit检测Forskolin/db-cAMP刺激HSF后上清液中总可溶性胶原的变化；Real-timePCR检测Forskolin/db-cAMP或Forskolin与AC拮抗剂SQ22536/ERK抑制剂PD98059联合刺激HSF后细胞内胶原Ⅰ，Ⅲ，VmRNA表达情况；3D方法培养HSF，观察Forskolin/db-cAMP影响胶原凝胶的面积大小；Westernblot方法检测Forskolin刺激HSF后细胞内信号传导通路蛋白CREB、ERK1/2磷酸化程度，探索cAMP调节HSF胶原合成的信号通路。
　　 结果：
　　 1．实验中所用药物浓度刺激HSF24h后对HSF细胞增殖无明显影响；
　　 2.10μMForskolin和100μMdb-cAMP可以显著增加细胞内cAMP水平；
　　 3.100nM-10μMForskolin/db-cAMP均可以抑制HSF上清中总可溶性胶原量表达；
　　 4.100nM-10μMForskolin/db-cAMP可以抑制HSF胶原Ⅰ，Ⅲ，VmRNA的表达，而100μMSQ22536与10μMForskolin联合应用可以部分抵消由Forskolin所抑制的HSF胶原Ⅰ，Ⅲ，VmRNA表达的能力；
　　 5．与对照组相比，1μMdb-cAMP/10μMForskolin可以抑制胶原凝胶收缩；
　　 6.10μMForskolin刺激HSF10min后，ERK1/2、CREB的磷酸化水平升高，60min后降低；
　　 7.10μMForskolin与10μMPD98059联合刺激HSF后，PD98059可以部分抵消由Forskolin抑制的HSF胶原Ⅰ，Ⅲ，VmRNA的表达。
　　 结论：
　　 1．通过升高细胞内cAMP水平，可以抑制HSF的胶原合成；
　　 2．cAMP可以通过激活ERK1/2蛋白来调节HSF胶原合成；
　　 3．cAMP有可能成为近视药物治疗研发的新的分子靶点，为近视的药物治疗开发奠定基础。