夹心ELISA法检测广州管圆线虫病循环抗原及初步应用

摘要

广州管圆线虫(AngiostrongyluscantonensisAC)的幼虫可侵入人体中枢神经系统，导致嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎，称为广州管圆线虫病，简称“酸脑”。而该病的确诊依据，主要是从患者脑脊液、眼或尸解时从脑、脊髓腔或肺动脉查到广州管圆线虫幼虫、幼龄成虫，但实际上虫体检出率很低，效果不太理想。
　　 自20世纪50年代以来，免疫学和免疫检测技术的发展为广州管圆线虫病提供了科学的诊断手段，同时随着免疫学方法的改进和创新，大大提高了广州管圆线虫病诊断的准确性。检测广州管圆线虫病患者血清抗体存在以下缺陷：一是感染后抗体出现较晚；二是完全治愈后抗体仍会存在较长时间，无法进行现症感染诊断和疗效考核；三是与其他蠕虫存在交叉反应。检测循环抗原(CAg)则可以克服以上的问题，因此我们对夹心ELISA法检测广州管圆线虫病患者血清中循环抗原进行研究非常有意义。
　　 目的：
　　 制备抗广州管圆线虫五期幼虫55KD抗原的单克隆抗体和相应的多克隆抗体，采用双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫病人血清中的循环抗原，并确定最佳检测条件，探讨其在广州管圆线虫病检测方面的意义。
　　 方法：
　　 (1)电渗纯化广州管圆线虫五期幼虫55KD抗原，并用此抗原免疫小鼠后，进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌McAb的杂交瘤细胞株，获取分泌抗广州管圆线虫五期幼虫55KD抗原的杂交瘤细胞株。蛋白质免疫印迹(Westernblotting)及间接ELISA分析其特异性，初步探讨其在广州管圆线虫病诊断及治疗中的应用。
　　 (2)用广州管圆线虫五期幼虫55KD抗原免疫兔子，制备多克隆抗体。用多克隆抗体和单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫病人血清中循环抗原，并确定最佳检测条件，利用该法进行人群血清检测。
　　 结果：
　　 (1)筛选出2株高滴度分泌抗广州管圆线虫五期幼虫55KD抗原的杂交瘤细胞株，分别命名为AVC1和ACV2。Westernblotting显示2株单克隆抗体均能与广州管圆线虫五期幼虫55KD抗原发生特异性结合，经免疫球蛋白类和亚类鉴定均为IgG2b，免疫组化结果显示2株单克隆抗体与广州管圆线虫五期幼虫的识别部位主要是在广州管圆线虫体表和消化道。
　　 (2)双抗体夹心ELISA法检测条件的确定
　　 包被抗原浓度选定为1.0mg/ml，检测抗体的最佳工作浓度应在0.2mg/1，酶标抗体的最佳工作浓度应在1∶1000，包被方式和封闭方式分别为4℃包被过夜、37℃封闭2小时，反应时间为标本孵育时间60分钟、检测抗体孵育时间60分钟、酶结合物孵育时间45分钟的反应体系。
　　 (3)建立双抗体夹心ELISA法，检测诸暨、温州、乐清、瑞安和苍南等地的人群血清，对应阳性率分别为0.6％、0.59％、0.57％、0.98％、2.43％、1.86％、1.18％。
　　 结论:
　　 (1)制备的2株稳定分泌抗广州管圆线虫五期幼虫55KD抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，特异性和稳定性较好，有望将其应用于广州管圆线虫感染的早期检测。
　　 (2)并成功建立了双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫病人血清中循环抗原，并对诸暨、温州、乐清、瑞安和苍南等地的人群血清进行检测，为临床检测、诊断该病奠定了基础。