线粒体CytB变异与中国汉族人群2型糖尿病相关性研究

摘要

目的： 1.分析中国浙江省汉族人群中线粒体CytB基因和剑桥标准序列(rCRS)的差异，寻找CytB基因变异的位点，用以研究其差异是浙江省汉族人群的多态性位点还是引起2型糖尿病的突变位点。 2.分析CytB基因变异与 T2DM主要临床生化指标之间的相关性，寻找相关的多态性位点，为T2DM及其并发症的遗传危险因素评估提供参考 方法： 1.标本采集：按照1999年WHO提出的 T2DM诊断标准，选取2009年3月-2010年10月期间于温州医学院附属第一医院八院区内分泌科随机收集的无血缘关系的 T2DM患者792例，且其中男420例，女372例；随机收取性别、年龄匹配的健康对照组标本共504例，男159例，女243例，无糖尿病及其并发症病史，无糖尿病家族史、糖耐量异常史，无高血压、高血脂、脑血管病变史，且无肿瘤病史。 2.全血DNA提取：通过DNA提取试剂盒提取采集的所有外周血标本全基因组DNA。 3.PCR扩增纯化测序：采用覆盖线粒体ONA(mitochondrial DNA，mtDNA)CytB-基因的第21、22对引物进行PCR扩增。扩增后使用纯化试剂盒进行纯化并直接测序 4.序列比对：直接测序后应用分析软件DNAStar、Chromas、Condone CodeAligner等分析，与剑桥参考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)进行比对，查找变异位点。 5.结果分析：运用统计学分析 T2DM组与对照组CytB变异情况的差异；通过生物软件Clustalx分析其碱基序列保守性；借助蛋白质数据库对二级结构进行预测，探讨CytB变异与T2DM分子机制的相关性。对筛选出来的有意义变异位点进行家系采集，所采集的家系从临床资料、线粒体基因全序、进一步保守性分析及单体型几个方面分析；分析CytB变异与糖尿病临床指标及其慢性并发症的相关性。 结果： 1在791例T2DM患者中共发现线粒体CytB中142个位点碱基变异，其中17个变异未报道，65个位点的碱基变异仅存在于T2DM组；504例对照中共发现119个位点碱基变异，11位点未报道，44个位点碱基变异仅存在于对照组。各变异位点在两组间统计学差异无显著性，但是总体变异频率却有显著性差异。其中C14766T、A15326G位点在两组实验中检测到变异率均大于96％。 2 T2DM组中有59个错义变异中，14个变异位点导致了氨基酸性质的改变。其中非极性疏水性氨基酸转到极性中性氨基酸改变为多数，共19个位点，其次时极性中性氨基酸转到非极性疏水性氨基酸改变，共12个位点。 3 CytB基因变异率在T2DM组中发生的变异频率与健康对照者相比，并没有显著差异性(P>0.05)。 4从物种进化保守性角度发现，T2DM患者CytB保守区域一些位点发生变异，在20余种哺乳动物里高度保守，其中是T15018A、G15119A、G15221A、A15758G、G15884A五个位点在健康对照组未发生变异。虽然这些位点在两组之间无统计学差异，但相应病例糖尿病进展迅速；A15258G变异仅出现在健康组。 5筛查到的变异位点T14783C、G15043A、G15301A在糖尿病肥胖组(BMI≥25kg/m2)的发生率高于糖尿病非肥胖组(BMI<25kg/m2)，具有显著统计学意义(P<0.05)，在糖尿病非肥胖与健康之间无统计学差异。 6变异位点T14783C、G15043A、G15301A在糖尿病高血压患者与糖尿病非高血压患者中差异无统计学意义，但是在糖尿病非高血压与健康人之间有统计学意义(P<0.05)。 结论： 1.线粒体CytB是一高变基因片段，在T2DM患者与健康对照人群中均有较高变异率。虽然两组间变异位点无统计学差异，但总变异频率在两组间有显著差异。 2.研究对象中C14766T、A15326G变异率均大于96％。在欧洲人群是少见多态性位点，这两个位点可做为中国人群mtDNA的参考位点和对剑桥参考序列的修正。 3.变异位点T14783C、G15043A、G15301A有较高的发生率，总是同时出现。而三个位点在肥胖和伴发高血压的T2DM患者中发生率较高，表明某一单倍型(含T14783C、G15043A、G15301A变异)的个体更具有发生糖尿病、肥胖和高血压等疾病的可能性。 4.变异位点T15018A、G15119A、G15221A、A15758G、G15884A可能加速了糖尿病病程的进展