EGCG对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖与凋亡的实验研究

摘要

[目的] 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从绿茶中提取的一种儿茶素类物质，是绿茶主要的活性和水溶性成份，在儿茶素类中的含量占80％左右。EGCG是儿茶素中抗氧化作用最强的一种成分，属非酶抗氧化剂。具有明显的清除体内自由基、抗癌、抗炎、抗突变、抗衰老及改善肝功能等生物活性，现已被列为潜在的抗癌药物在中美等国被研究，但在人舌磷癌方面的研究极少。本实验主要通过EGCG作用于在体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞系，初步研究其对人舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制及诱导凋亡的影响，并讨论EGCG可能的作用机理。 [方法] 1、对购自于中国科学院上海细胞生物学研究所的人舌鳞癌Tca8113细胞系进行常规培养，并观察细胞生长状况。待细胞生长状态良好，予以冻存细胞，备用。用倒置显微镜观察不同浓度EGCG对人舌鳞癌Tca8113细胞生长状态的影响并拍照。 2、采用CCK-8法检测不同浓度的EGCG(0、10、20、40、80μg/mL)对Tca8113细胞的体外增殖抑制作用。 3、采用AnnexinV-FITC/PI双染色法以及流式细胞术，从细胞性质上检测不同浓度的EGCG对人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡情况的影响。 4、采用DAPI荧光染色法从形态学上检测不同浓度的EGCG对人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡情况的影响。 [结果] 1、用含10％小牛血清(杭州四季青公司)的Hyclone改良型RPMI1640培养基(内含1×105U/L青霉素、链霉素)常规培养人舌鳞癌Tca8113，状态良好。细胞生长速度较快，3天左右即可传代一次。取对数生长期细胞予以冻存。用倒置显微镜观察结果显示：10μg/mLEGCG处理后与未加药组相比较，细胞数目、形态及体积未见明显改变；20μg/mL EGCG处理Tca8113细胞48h后出现细胞体积缩小，形态不规则，数目减少；40μg/mL与80μg/mL EGCG处理Tca8113细胞48h后细胞数目出现明显减少，细胞间间隙增大，细胞皱缩，培养液中见大量悬浮细胞及细胞碎片等。 2、CCK-8法检测结果显示：与未加药组相比较，10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml EGCG在各时间段(加药后24h、48 h、72 h)均出现对Tca8113细胞有明显抑制作用，呈现时间及浓度依赖性(与未加药组相比较，P<0.01，差异有统计学意义)。但高浓度80μg/ml EGCG处理的Tca8113细胞抑制率在各时间段之间未发现显著差异(P>0.05)。 3、流式细胞仪检测结果显示：经10μg/mlEGCG处理的Tca8113细胞凋亡率还不能认为与对照组有区别(P>0.05)，其余EGCG处理组细胞凋亡率均高于对照组并呈现浓度依赖性(P<0.01)；40μg/mLEGCG作用Tcea8113细胞24h、48h和72h后，其早期和晚期凋亡率较对照组(0小时)依次明显增加(P<0.01)，证实了EGCG诱导Tca8113细胞凋亡呈现时间依赖性。 4、各浓度梯度EGCG处理Tca8113细胞48h后，免疫荧光显微镜下观察结果显示：未加药组Tca8113细胞细胞核体积、形态正常，均质蓝染，呈卵圆形或圆形。20μg/mL EGCG处理组出现细胞核皱缩，体积缩小，形态略不规则。40μg/mL与80μg/mL EGCG处理组出现明显凋亡，细胞核碎裂，形态不规则，可见典型的凋亡小体及细胞核残片等。 [结论] 低浓度EGCG(10μg/mL)处理Tca8113细胞后，未观察到明显的增殖抑制及诱导凋亡作用，随着EGCG浓度的增加，对Tca8113细胞出现明显的增殖抑制及诱导凋亡作用，且呈现时间及浓度依赖性。