聚乙二醇包覆的磷酸钙纳米复合颗粒作为小RNA非病毒载体的研究:制备条件与性能关系

摘要

目的 利用磷酸钙制备PEG-PAsp(DET-Aco)/siRNA/CaP纳米复合粒子，探索制备条件对其物理-化学性能的影响，并研究纳米粒子在缓冲溶液中的稳定性、细胞毒性以及对报告基因的沉默效率。 方法 1.纳米复合颗粒的制备：PEG-PAsp(DET-Aco)样品由合作单位提供。制备PEG-聚阴离子共聚物/siRNA/CaP纳米复合粒子。 2.纳米复合粒子的平均粒径和粒径分布、siRNA包封率的测定 1)纳米粒子的制备条件，如缓冲液PH、PEG分子量及磷酸盐类型对纳米粒子的粒径的影响，从而可以优化纳米粒子的制备条件，并掌握调节纳米粒子粒径的条件。 2)利用动态激光光散射(DLS)和透射电镜(TEM)方法来表征纳米粒子的粒径及粒径分布。 3)测定PEG-PAsp(DET-Aco)/siRNA/CaP纳米复合颗粒在缓冲溶液中的稳定性。 3.PEG-PAsp(DET-Aco)/siRNA/CaP纳米粒子的体外细胞实验采用Huh-7细胞株存活率的测定来考察纳米粒子的细胞毒性；利用激光共聚焦显微镜(CLSM)来考察荧光标记的纳米粒子的细胞摄取途径；采用瞬时表达双报告基因的细胞评价纳米粒子对上述报告基因的基因沉默效率。 结果 制备了PEG-PAsp(DET-Aco)/siRNA/CaP纳米复合颗粒。通过透射电子显微镜观察和动态光散射测试，结果显示，该纳米颗粒呈现规则的球型，平均粒径为70nm，并且粒径分布非常窄(多分散指数PDI小于0.1)。siRNA包封率测定结果表明，所制备的纳米粒子具有较高的siRNA结合效率，70-85％的siRNA结合到纳米复合粒子中。在37℃生理缓冲溶液中纳米颗粒粒径在7小时内基本不发生改变，显示了较好的稳定性。细胞存活率数据表明，装载siRNA的纳米复合颗粒具有非常低的细胞毒性。体外细胞实验结果显示，PEG-PAsp(DET-Aco)/siRNA/CaP纳米复合粒子具有较高的对目标报告基因的沉默效率。 结论 聚乙二醇磷酸钙纳米复合粒子制备简单，所得到的纳米颗粒粒径小分布窄，在生理缓冲液中性状稳定，生物毒性低，能有效地给细胞内吞，并实现显著的基因抑制效果。