炎症状态下张应力对成骨细胞MMP--13/TIMP--1表达的影响

摘要

目的:口腔正畸治疗可以协助牙周治疗最大限度的恢复牙周病患者正常的口颌系统功能。如何才能实现静止期炎症状态下牙齿安全有效的正畸治疗成为正畸医生极为关注的问题。本实验通过研究炎症上清液及周期性张应力作用下，小鼠成骨细胞系MC3T3-E1基质金属蛋白酶-13(MMP-13)和金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的表达变化，来探讨炎症状态与力学作用下骨改建的机制，为进一步研究炎症状态下正畸应力对骨改建的影响提供理论依据。 方法:取100ng/ml的牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPs)于培养液中刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)，收集24h后的培养上清液并稀释至20％浓度后作为炎症上清液。本实验分为四组：NI-NF组为空白对照组，MC3T3-E1成骨细胞正常培养；I-NF组为单纯炎性刺激组，取20％稀释浓度的PgLPs刺激单核细胞培养的炎症上清液，与MC3T3-E1细胞共孵育24h：NI-F组为非炎性刺激加力组，对MC3T3-E1成骨细胞加载2000μ strain、0.5Hz循环单轴张应力，分别取加力5分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时后观察：I-F组为炎性刺激加力组，取20％稀释浓度的PgLPs刺激单核细胞培养的炎症上清，与MC3T3-E1细胞孵育24h后加载2000μ strain、0.5Hz循环单轴张应力，分别取加力5分钟、30分钟、1分钟、3分钟、6分钟后观察。观察各组细胞形态变化，并采用实时荧光定量PCR技术和免疫组化法检测基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的mRNA及蛋白表达水平的变化。 结果:1、细胞形态变化：NI-NF组MC3T3-E1成骨细胞生长良好，光镜下观察细胞呈梭形、三角形或不规则多边形，有2～3个突起伸出，胞质透亮、饱满。I-NF组细胞呈扁平状，细胞浆中颗粒增多，有空泡状出现，透光性下降。NI-F组镜下观察细胞呈梭形、三角形或不规则多边形，突起伸出增多，细胞拉长，可呈一定的定向性排列。I-F组细胞呈长梭形、胞体扁平状，细胞质中颗粒及空泡状出现明显增多，细胞透亮度降低，细胞膜边缘毛糙，突起伸出增多，部分2、炎症状态下张应力对成骨细胞MMP-13表达的影响荧光定量PCR及免疫组化结果显示，炎症上清孵育的MC3T3-E1细胞，在加载周期性张应力后MMP-13的表达明显增加，并随着加力时间的延长而逐渐增加，不同时间段的表达差异有统计学意义(P<0.05)。 3、炎症状态下张应力对成骨细胞TIMP-1表达的影响荧光定量PCR及免疫组化结果显示，炎症上清孵育的MC3T3-E1细胞，在加载周期性张应力后TIMP-1的表达明显增加，并随着加力时间的延长而逐渐增加，不同时间段的表达差异有统计学意义(P<0.05)。 结论:小鼠成骨细胞系MC3T3E1在炎症上清和周期性张应力作用下，MMP-13的mRNA和蛋白表达与对照组相比显著增强，并随着应力刺激时间的增加，表达量逐渐增加。但同时其抑制因子TIMP-1也随着加力时间的增加而处于明显增高的水平，表示这个阶段MMP-13活性依然相对受到抑制，从而调节MMP-13/TIMP-1达到相对的动态平衡，可使Ⅰ型胶原分解作用也受到相应的抑制。同时本实验结果也提示我们在炎症状态下加载张应力，骨代谢细胞将产生更高水平的影响骨吸收的细胞因子，并在一定加力时间范围内逐渐升高。研究结果表明在炎症状态下机械应力通过对成骨细胞MMP-13＼TIMP-1表达的影响，调节细胞外基质的降解过程，可能是炎症状态下正畸牙齿移动过程中骨改建的一个重要机制。