发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构蛋白和非结构蛋白表达研究

摘要

对于新发传染病，从流行病学角度而言，如何有效控制传染源、及时切断传播途径、保护易感人群，是预防及控制疾病爆发及流行的关键。同时从病原学角度而言，对新发疾病病原体的病毒基因组、病毒颗粒结构及如何感染宿主细胞等生物学活性进行认识同样重要。发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severefever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)，是2010年我国新分离到的一种对人类具有致病性的布尼亚科白蛉病毒属病毒，其感染病例主要表现为发热、血小板减少，严重者出现多脏器的功能衰竭进而死亡。由于发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)在人群的普遍易感，且尚无有效的预防及治疗的措施，因此，研究SFTSV对于预防和控制SFTS的暴发流行具有重要的意义。 SFTSV为单负链、分节断的RNA病毒，其基因组分为L、M、S三个片段，根据与同属于白蛉病毒属的立夫特谷热病毒(Rift valley fever virus，RVFV)、乌库病毒(Unkuniemi virus)、潘塔托若病毒(Punta Toro virus)编码蛋白序列比对发现：就RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)而言，SFTS(HB29)与UUK(S23)的同源性最高，其同源性为33％；就M片段编码的糖蛋白(glycoproteins，Gnand Gc)而言，SFTS(HB29)与UUK(S23)的同源性最高，其同源性为36％；就S片段编码的NP蛋白而言，SFTS(HB29)与RVF(74HB59)的同源性最高，其同源性达41％，而就非结构蛋白NSs而言，差异较大，同源性介于11％～14％。故推测：基因组L片段编码依赖RNA的RNA聚合酶蛋白(RNA dependent RNApolymerase，RdRp)；基因组M片段编码N端糖蛋白(glycoprotein n，Gn)和C端糖蛋白(glycoprotein c，Gc)及S片段编码核蛋白(nuclear protein，NP)和非结构蛋白(Non-Structure S protein，NSs)。本研究研究目的为证实SFTSV蛋白是否由推测的基因组编码。 与原核表达系统相比，真核表达系统具有准确的转录、翻译后加工修饰功能及跨膜转运机制的特点，有利于表达蛋白的正确组装，促使重组蛋白更接近于天然病毒蛋白的结构，具有较为完整的生物学活性。在真核表达系统又可分为：酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳细胞表达系统。本研究选择哺乳动物细胞表达系统及杆状病毒-昆虫细胞表达系统来进行SFTSV结构蛋白和非结构蛋白的表达研究。 本研究主要分为两大部分： 第一部分：利用PCR方法扩增SFTSV(HB29株)病毒RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白前体蛋白(M)、包膜糖蛋白(Gn)、包膜糖蛋白(Gc)、核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)的编码区基因片段，分别克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT或VR1012，在293T细胞上获得上述基因表达。通过SDS_PAGE分析纯化病毒颗粒和重组蛋白，并通过免疫印迹(Western Blot)和间接免疫荧光(IFA)确定蛋白活性。本部分的研究结果将有利于对SFTSV分子生物学特征的认识，为后期研究提供前期基础。 第二部分：我们首先对SFTSV(HB29)病毒的M片段的编码区及S片段中NP和NSs的读码框分别扩增，然后克隆入昆虫细胞表达载体pAcuw51g中，构建了一系列经酶切鉴定及序列测定均正确的SFTSV重组蛋白表达质粒。为了研究上述重组表达载体是否具有生物学活性，我们将其转染Sf9细胞，并通过间接免疫荧光、Western blot方法检测SFTSV重组结构蛋白和非结构蛋白的表达情况。结果显示，所有重组载体转染相应细胞后，重组蛋白在细胞内均得到有效的表达。同时，重组的NP蛋白实现了分泌表达。通过对NP蛋白纯化并进行免疫原性研究，结果显示NP蛋白具有良好的免疫原性，刺激小鼠产生抗SFTSV-NP蛋白的特异性IgG抗体。此外，利用pAcuw51g载体具有双启动子的特性，将NP和Gn+Gc分别置于P10和polyherdrin两个启动子下，构建SFTS病毒样颗粒重组表达载体并转染Sf9细胞，通过蔗糖垫层超速离心后透射电镜可观察到形态类似天然病毒的颗粒样结构。 综上所述，本研究成功构建了发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构蛋白和非结构蛋白的真核重组表达载体，以上结果为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构的研究奠定了良好的基础，也为研究发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒颗粒的结构进行了有益的探索。