rhFGF--2的N末端固相PEG修饰及修饰产物的性能研究

摘要

目的：建立一种新型PEG化学修饰工艺-以肝素琼脂糖色谱柱作为固相载体的固相修饰，改善rhFGF-2在液相PEG修饰时出现的单一修饰率不高，活性低等缺陷。优化rhFGF-2在固相条件下N末端PEG修饰条件及分离纯化条件，对修饰产物的活性、受体结合能力、空间结构、热稳定性和胰蛋白酶稳定性、免疫反应性以及生物学半衰期等生物学性能进行评价。 方法：本研究采用的固相修饰主要在肝素琼脂糖色谱柱上进行，首先将蛋白结合到肝素柱上，然后将mPEG20kDa-丁醛反应液作为流动相，作低流速循环，反应一定时间后高盐洗脱收集得到修饰混合物备用。在液相修饰的基础上，我们对影响固相反应的2个主要参数，即反应过程中rhFGF-2与PEG的摩尔质量比和反应时间进行了优化。摸索出一种有效的分离方法，以期得到高纯度的PEG-rhFGF-2。考虑到rhFGF-2修饰前后肝素亲和性可能会有变化，我们直接在肝素柱上进行了分离纯化，然而结果不是特别理想。根据修饰前后蛋白的分子量差异：rhFGF-2为16 kDa，而PEG-rhFGF-2则为36 kDa左右，我们尝试采用S-100等分子筛层析法。然而，分子筛层析法对修饰产物无法进行有效分离，之后我们根据疏水性的变化采用HiTrap Octyl FF等疏水层析进行分离，但是结果依旧不好。最后我们采用HiTrap SP FF等强阳离子交换成功实现了对修饰产物的分离纯化，并且考察对主要影响因素如洗脱缓冲液离子强度等进行考察，得到一个优化条件。对分离纯化后的PEG-rhFGF-2，我们采用SDS-PAGE和RP-HPLC进行了鉴定。此外，我们通过MALDI-TOF-MS检测PEG-rhFGF-2的分子量，并以此确定蛋白的PEG修饰程度；采用Edman降解法测定蛋白N-端的5个氨基酸，确定PEG是否与rhFGF-2的N末端残基偶联；采用NIH3T3细胞分别检测PEG-rhFGF-2促增殖活性及激活MAPK通路的活性；SPR检测rhFGF-2修饰前后与FGFR1的结合能力变化：CD检测PEG修饰对rhFGF-2的二级结构有无影响；ELISA法检测修饰蛋白的免疫反应性；热稳定性实验和胰酶蛋白降解实验检测修饰蛋白的稳定性；大鼠静脉给药实验检测修饰前后rhFGF-2的生物学半衰期变化。 结果：优化影响PEG修饰的主要参数，得出PEG固相修饰的优化条件是：20mM，pH6.0磷酸盐缓冲液，rhFGF-2与PEG的摩尔质量比为1:8，室温反应8h。与液相修饰相比，本研究采用的修饰方法，明显提高了修饰产物的单一修饰率，修饰率达58.3％。通过一系列的纯化实验，得出的结论是：离子交换(SP FF)能够分离出纯度较高的PEG-rhFGF-2，纯化条件是：上样缓冲液为20 mM，pH7.0的磷酸盐溶液，洗脱液为含0.30 M NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0。SDS-PAGE和RP-HPLC的结果显示得到的修饰产物纯度达95％以上。MALDI-TOF-MS的结果表明PEG-rhFGF-2的分子量为37.7kDa，并且PEG-rhFGF-2 N端测序显示前五个循环的结果都是阴性，上述结果表明一分子PEG特异性结合到了一分子rhFGF-2的N-端α-氨基上。此外，生物学活性实验及SPR实验结果表明，本研究采用的固相PEG修饰方法对rhFGF-2的生物学活性无显著影响，且与液相PEG修饰相比，其更好的保留了rhFGF-2的活性；CD结果显示修饰前后rhFGF-2远紫外吸收趋势相同，表明固相PEG修饰对rhFGF-2的二级结构基本上无影响；PEG-rhFGF-2无论是热稳定性还是抗胰蛋白酶水解能力均得到了较大程度地提高；ELISA实验显示出修饰后的rhFGF-2在体外与抗体的结合能力仅为野生型的51％，这表明修饰后PEG长链遮蔽了抗体的部分结合位点，免疫反应性明显降低。另外，大鼠体内半衰期结果表明，rhFGF-2经过PEG修饰后体内半衰期由原来10.39 min延长到53.45 min，几乎是原来的5.2倍。 结论：本研究建立了稳定高效的rhFGF-2固相PEG定点修饰及纯化工艺，PEG-rhFGF-2不但保留了蛋白的生物学活性而且其热稳定性、抗胰蛋白酶水解能力著提高、免疫反应性降低、体内半衰期显著延长，这为拓展rhFGF-2和其他蛋白类药物的临床应用提供了一定的理论基础和研究思路。