羊栖菜多糖对内毒素诱导的大鼠肝星状细胞的影响

摘要

目的： 1.建立较为全面反映体外培养大鼠肝星状细胞T6细胞株(hepatic stellatecell-T6 strains，HSC-T6)活化效应的细胞模型2.观察不同浓度羊栖菜多糖(Sargassum Fusiforme Polysaccharides，SFPS)对内毒素(LPS)诱导的肝星状细胞HSC-T6的增殖活化、氧化损伤及凋亡的影响，并探讨其抗纤维化的机制。 方法： 1.不同浓度的LPS(0，0.01，0.1，1.0，10ug/ml)处理体外培养的大鼠HSC-T6，分别作用12，24，48小时后，四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖活性，筛选出有显著差异的药物浓度和作用时间建立模型。 2.不同浓度的SFPS(0，25，50，100，200，400，800ug/ml)+有效浓度的LPS(1.0ug/ml)处理细胞48小时后，MTT比色法检测细胞增殖活性。 3.经上述分组及处理，收集细胞，Annexin V-FITC标记法检测细胞的凋亡。 4.经上述分组及处理，收集上清液及细胞，硫代巴比妥酸法(thibabituricacid，TBA)测定细胞内的丙二醛(Maleic dialdehyde，MDA)含量，黄嘌呤氧化酶比色法测定上清液中的超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性。 5.经上述分组及处理，收集细胞提取RNA，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测凋亡调控基因FaslmRNA的表达。 6.6.经上述分组及处理，收集细胞提取蛋白，Western blot法检测α-SMA(43KDa)的表达。 结果： 1.不同浓度的LPS(0，0.01，0.1，1.0，10ug/ml)处理体外培养的大鼠HSC-T6，作用48h后，促进细胞增殖活性的作用在0.1～1.0ug/ml浓度范围内呈剂量相关性，1.0ug/m浓度组效果最明显。因此以1.0ug/mlLPS干预48小时建立模型。 2.SFPS不同浓度(0，25，50，100，200，400，800 ug/ml)+1.0ug/mlLPS处理细胞48小时后，抑制细胞增殖活性的作用在25～100ug/ml浓度范围内呈剂量相关性，100ug/ml浓度组效果最明显。随着计量的增加，细胞出现坏死变形较多，因此设置药物浓度为0，25，50，100ug/ml。设置分组为A组：空白对照组；B组：LPS1.0umol/L组；C组：1.0umol/L LPS+SFPS25 ug/ml组；D组：1.0umol/L LPS+SFPS50 ug/ml组；E组：1.0umol/L LPS+SFPS100ug/ml组。 3.Annexin V-FITC标记法检测细胞的凋亡率分别为A组：(7.4±1.4)％、B组(5.6.±2.1)％、C组(9.8±2.0)％、D组(12.7±1.7)％、E组(15.3±3.6)％，P<0.05，SFPS(25，50，100 ug/ml)组可以不同程度诱导HSC发生凋亡，并且呈计量相关性(均P<0.05)4.MDA含量(nmol/L)分别为A组1.50±0.1，B组43.24±0.13，C组2.45±0.14，D组2.19±0.12 E组1.79±0.10：SOD活力(U/ml)：A组43.17±1.34，B组27.31±3.05，C组23.10±3.08，D组30.84±1.85 E组36.33±2.39。模型组能增加MDA的分泌减少SOD的分泌，与模型组相比相比，SFPS(25，50，100 ug/ml)组可以不同程度增加SOD的分泌及减少MDA分泌(均P<0.05)5.Fas1mRNA的表达各组灰度比值分别为：A：0.14±0.04，B：0.66±0.03，C：1.31±0.08，D：1.43±0.02，E：1.70±0.02，F=215.23，P<0.01.模型组能增加Fas1mRNA的表达，与模型组相比相比，SFPS(25，50，100 ug/ml)组可以不同程度增加Fas1mRNA的表达(均P<0.05)6.Western blot法检测α-SMA的表达各组灰度比值分别为A：0.38±1.12，B：0.87±2.05，C：0.80±1.23，D：0.73±0.84，E：0.54±2.33，F=76.24，P<0.01，LPS能明显促进HSC表达α-SMA(P<0.01)，不同剂量SFPS作用后，LPS诱导的肝星状细胞分泌的α-SMA表达受到抑制并呈剂量依赖性(P<0.05)。 结论：LPS可明显促进体外培养HSC-T6的增殖，SFPS能明显抑制其增殖及活化并诱导其凋亡，凋亡途径可能与FAS/FASL通路有关，这可能是羊牺菜多糖抗肝纤维化的作用机制之一