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摘要
第1章绪论
1．1视网膜色素变性
1．1．1视觉、眼睛与视网膜
1．1．2视网膜与视觉疾病
1．1．3视网膜色素变性
1．1．4视网膜色素变性病因
1．2基因治疗
1．2．1基因治疗的目的
1．2．2基因治疗的发展
1．2．3基因治疗的分类
1．2．4基因编辑治疗
1．2．5在体基因治疗与视觉疾病
1．2．6在体基因编辑治疗应用与限制
1．3基因编辑治疗的研究现状
1．3．1基因编辑治疗的出现——核酸酶技术发展
1．3．2基因编辑治疗的曙光——CRI SPR/Cas9
1．3．3基因编辑治疗的快速发展
1．3．4基因编辑治疗走向临床
1．3．5基因编辑治疗的新策略
1．4选题意义
1．4．1选题理由
1．4．2创新点
第2章材料和方法
2．1实验试剂
2．1．1常用试剂
2．1．2常用溶液
2．2实验仪器
2．3实验动物
2．3．1动物伦理声明
2．3．2实验动物饲养
2．3．3转基因动物繁育
2．4实验方法
2．4．1小鼠基因鉴定
2．4．2质粒提取与质粒构建
2．4．3 mRNA检测
2．4．4体外同源重组效率检测
2．4．5幼鼠视网膜在体电穿孔转染
2．4．6视杆细胞修复检测
2．4．7 Cas9脱靶检测
2．4．8小鼠视网膜感光细胞形态学观察
2．4．9离体视网膜电图记录
2．4．10瞳孔光反射检测
2．5数据分析
2．5．1分析软件
2．5．2分析方法
第3章结果分析和讨论
3．1 Cas9／RecA系统设计原理
3．1．1 Cas9系统诱导双链断裂
3．1．2 RecA促进链交换反应和同源修复序列的富集
3．1．3 MS2系统可以将RecA蛋白拉到Cas9作用位点附近
3．1．4小结
3．2 Cas9／RecA系统可以促进体外细胞的同源重组效率提升
3．2．1 Cas9／RecA系统不影响非同源粘性末端连接效率
3．2．2 Cas9／RecA系统可以促进同源重组效率提升
3．2．3小结
3．3．2 rd1小鼠pde6b基因内含子插入序列不影响mRNA剪接
3．4 Cas9／RecA系统诱发了在体同源重组修复
3．4．1 Cas9／RecA系统在体编辑系统设计
3．4．2分子生物学手段检测同源重组的发生
3．4．3 Cas9／RecA系统在体基因编辑治疗过程中未检测到脱靶
3．4．4小结
3．5 P0阶段干预延缓了视网膜光感受器细胞的退化
3．5．1视杆细胞退化显著抑制
3．5．2视锥细胞退化显著抑制
3．5．3修复的视杆细胞和视锥细胞集中在视网膜中心区域
3．5．4小结
3．6 P3阶段干预延缓了视网膜光感受器细胞的退化
3．6．1 P3阶段小鼠视网膜光感受器细胞处于非分裂状态
3．6．2视杆细胞退化显著抑制
3．6．3视锥细胞退化显著抑制
3．6．4小结
3．7生理功能检测显示Cas9／RecA系统修复的有效性
3．7．1 Cas9／RecA系统修复rd1小鼠出现感光能力
3．7．2视杆细胞贡献了修复的感光能力
3．7．3感光诱发的电活动随光强增加而增加
3．6．4 P3天修复也可以修复部分感光能力
3．6．5所修复的光感受器细胞可以向下传递电活动
3．6．6小结
3．8行为学检测显示Cas9／RecA系统修复的有效性
3．8．2弱光下的瞳孔光反射由视杆细胞介导
3．8．3小结
3．9结论
3．10讨论
3．10．1 Cas9／RecA系统对于促进同源重组修复的意义和有效性
3．10．2非分裂细胞实现同源重组修复
3．10．3视锥细胞残留为基因编辑治疗视杆细胞后的继发性治疗过程
3．10．4比较多种基因编辑手段Cas9／RecA具有明显的优势
第4章总结和展望
4．1拓展应用到非人灵长类动物模型中
4．2在体基因编辑治疗的不断加深突破
4．3促进基因编辑研究领域的交叉融合
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文以及所获奖项
中国科学技术大学;
