Fsp27基因抑制肝脏纤维化及体外抑制肝星状细胞增殖活化的实验研究

摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是各类慢性肝病共同的病理学基础。其中25％-40％最终发展为肝硬化甚至肝癌，是一类世界性的严重危害人们健康的主要疾病。有较多研究显示，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化与增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。HSCs增殖激活后可分泌大量细胞外基质，引起胶原纤维沉积导致纤维化。阻止HSCs的增殖活化有可能阻断肝纤维化肝硬化的进程。针对HSCs的有关肝纤维化机制及对其防治的研究，近年已成为国内外生物学、医学研究的热点之一。 国内外较多研究显示，激活过氧化物增殖酶体的受体γ(peroxisomeproliferatot-activated receptor gamma，PPAPγ)能显著抑制HSCs的增殖激活，同时抑制HSCs中肝纤维化相关基因的表达，从而逆转活体肝纤维化进程。但对于PPAPγ通过何种途径对HSCs产生作用目前研究尚不十分明确。针对脂肪细胞的研究提示脂肪特异性蛋白27(fat-specific protein27，Fsp27)是脂肪细胞胞浆内脂滴形成的一个重要基因，并在肝脏中是PPARγ的直接目标基因，PPARγ对脂肪细胞储脂功能的实现主要通过Fsp27这个下游基因而实现。众所周知，HSCs是肝脏中的储脂细胞，我们的研究是直接探讨Fsp27基因能否对HSCs活化增殖过程产生影响及进一步通过活体实验验证抗纤维化疗效。 为了研究Fsp27基因能否对HSCs活化增殖过程产生影响及进一步通过活体实验验证抗纤维化疗效，我们对小鼠原代HSCs的提取方法进行了改良，通过RT-qPCR技术检测FSP27基因分别在原代及活化的HSCs中的表达变化，构建携带Fsp27基因的慢病毒载体，转染活化的HSCs，研究该基因对HSCs增殖、活化的影响，同时进一步病毒感染四氯化碳(CCL4)喂养建立鼠的肝硬化门脉高压症模型，探讨该基因在活体实验中的抗纤维化疗效。 第一部分：改良小鼠HSCs的分离、培养及性质鉴定 目的：通过改进BALB/c小鼠HSCs的分离、培养方法，提高其分离质量，为进一步研究原代HSCs的性状及影响HSCs的增殖活化的因素奠定实验基础。 方法：选用25-30g体重小鼠，结扎上、下腔静脉，经下腔静脉D-HanK’s液灌注，冲洗出肝脏血管内的血液；然后采用胶原酶(0.3 mg/mL)手工逆灌注肝脏10 min，游离并取下肝脏剪碎，用HBSS液20 mL(0.3 mg/mLⅣ型胶原酶、20μ g/mL DNA酶)消化肝脏组织；使用optiprep密度梯度分离液，离心分离小鼠HSCs。用含血清DMEM培养HSCs，台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力；desmin、α-SMA免疫细胞化学检测进行HSCs性质鉴定。 结果：HSCs的得率稳定在2×105个/鼠以上，纯度为93％-97％左右，HSCs存活率存活率为95％-97％。新分离未贴壁的HSCs呈圆形，胞浆折光性很强；培养24 h后，大部分细胞已贴壁；48 h后绝大部分贴壁，胞浆内可见脂滴，细胞开始伸展，一部分细胞出现多角伪足；培养7 d左右，细胞开始呈现典型的星状外形，胞浆内颗粒减少，增殖细胞形态较大，并呈局灶性生长。刚分离的HSCsα-SMA染色阴性，desmin阳性染色90％左右，培养7 d的HSCs desmin、α-SMA阳性染色均达100％。 结论：改良optiprep密度梯度离心方法分离、培养的小鼠HSCs得率高，活性保存好，且操作简单易行，适于广泛开展，有利于原代小鼠HSCs的生物学研究，具有良好的科研应用价值。 第二部分：Fsp27基因的慢病毒载体的构建及其在星状细胞株HSC-T6中的表达 目的：构建携带鼠Fsp27基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的表达，为进一步研究Fsp27基因对HSCs增殖活化的影响奠定实验基础。 方法：从大鼠基因库中提取并用PCR方法扩增Fsp27基因，构建Fsp27重组表达载体pLV-Fsp27，将重组慢病毒载体转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染293T细胞，根据RT-qPCR法测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及Fsp27慢病毒感染组，用Real-Time qPCR方法检测Fsp27 mRNA的表达。 结果：PCR扩增检测阳性菌落和测序证实，成功构建大鼠Fsp27基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见，293T细胞呈绿色荧光，并测得病毒滴度为2.00E+8 TU/ml。重组慢病毒感染HSC-T6后，RT-qPCR方法检测到Fsp27 mRNA稳定表达。Fsp27慢病毒感染组与空病毒对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；空病毒对照组与空白组比较，差异无统计学意义(P<0.05)。 结论：成功构建了带有鼠Fsp27基因的慢病毒载体，并实现其在HSC-T6的稳定表达，为后续进一步研究Fsp27基因对HSCs增殖活化的影响奠定了良好基础。 第三部分：Fsp27基因抑制大鼠肝星状细胞增殖、活化及体内抑制肝纤维化的研究 目的：探讨Fsp27基因对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖、活化的影响及其对活体肝纤维化模型的治疗作用。 方法：培养HSCs，构建携带Fsp27目的基因的慢病毒载体，转染活化的HSCs并继续培养，通过CCK-8比色法检测Fsp27基因对HSCs增殖的影响；Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(α-SMA)的表达，了解HSCs的活化状态；研究Fsp27基因对HSCs纤维化相关基因表达的影响；利用50％四氯化碳(CCl4)1.5ml/kg腹腔注射10-12 w，建立鼠肝纤维化模型；经门静脉输注携带Fsp27目的基因的慢病毒(3.0×108TU/次)，检测肝组织病理切片，肝纤维化指标，肝组织α-SMA的表达。 结果：活化的HSCs成功转染带Fsp27目的基因的慢病毒后继续培养72 h，与对照组比较，明显抑制HSCs的活化与增殖，差异具有统计学意义(P<0.05)，Fsp27基因对MMP-2基因的表达具有促进作用，而抗纤溶基因TIMP-1及TGF-β1表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。成功制的鼠肝纤维化模型后，进一步活体实验显示Fsp27基因的表达能够减少肝脏纤维胶原蛋白的含量，降低血浆透明质酸、Ⅲ型胶原水平。 结论：Fsp27基因具有抑制HSCs活化、增殖的潜能，对活体肝纤维化进程具有一定的抑制作用，Fsp27基因可通过促进MMP-2基因的表达，降低TIMP-1及TGF-β1的表达，从而促进基质纤维的降解。Fsp27基因的作用可能与维持HSCs静息状态细胞表型有关。