敲低HIF-1α基因对乙醛刺激的肝星状细胞增殖活化影响的实验研究

摘要

目的：
　　酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是因过量摄入酒精引发的中毒性肝脏病变，早期通常表现为酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver disease，AFLD）可进展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化(alcohol liver fibrosis，ALF）、肝硬化、甚至肝癌。ALF病因明确，但其发病机制尚未完全清楚。目前认为肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs）增殖与活化是肝纤维化发生的核心环节。近十多年来国内外研究表明，缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作为低氧应答调控的管家基因，可能通过其调节的靶基因参与HSCs的活化与增殖。HIF-1是由调节亚基HIF-1α与结构性亚基HIF-1β共同组成的异源二聚体，HIF-1α对HIF-1发挥转录因子活性起着至关重要的影响，在细胞内水平受到氧依赖和非氧依赖信号事件的调控。有研究者用内毒素培育人肝星状细胞系，发现HIF-1α高表达，且标志HSCs活化的I型胶原蛋白（Collagen I）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）高表达，抑制HIF-1α表达后，I型胶原蛋白及α-SMA表达也随之减低。我们前期在酒精灌胃构建的大鼠ALD模型中观察到：随着造模时间的延长，肝组织HIF-1α mRNA和蛋白表达随之增多，提示HIF-1α可能参与着ALD发病过程。本研究选用200μmol/L乙醛刺激大鼠HSC-T6细胞，特异性抑制HIF-1α表达，观察HSC-T6细胞增殖情况及α-SMA和Collagen I表达变化。旨在细胞水平阐明抑制HIF-1α表达对HSC-T6细胞增殖及α-SMA和Collagen I表达影响，探讨HIF-1α调控的HSCs在ALF中的作用。
　　方法：
　　复苏HSC-T6细胞用含10％胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基在5% CO2，37℃条件下培养到对数生长期。实验分为正常对照组（常规培养）、乙醛刺激组（终浓度为200μmol/L）、HIF-1αsiRNA组（siRNA100nm/L+乙醛终浓度为200μmol/L）、HIF-1αsiRNA阴性对照（negative control, NC）组（NC siRNA+乙醛终浓度为200μmol/L）。利用200μmol/L乙醛刺激大鼠HSC-T6细胞，将HIF-1αsiRNA、NC siRNA通过脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染至HSC-T6细胞，培养6h后，更换为新鲜完全培养液继续培养48h，应用CCK-8检测大鼠HSC-T6细胞增殖变化；收集细胞，分别利用RT-qPCR和Western blot法检测HIF-1α、α-SMA和Collagen I mRNA和蛋白表达水平；用4%多聚甲醛固定，行免疫荧光染色，观察α-SMA蛋白表达情况。
　　结果：
　　1转染HIF-1αsiRNA敲低HIF-1α基因对大鼠HSC-T6细胞增殖的影响
　　瞬时转染HIF-1αsiRNA48h后，细胞增长情况明显减慢，CCK-8比色结果：与正常对照组比较，乙醛刺激组OD值明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01），提示200μmol/L乙醛可明显促进 HSC-T6细胞增殖；HIF-1αsiRNA组OD值与乙醛刺激组比较，细胞增长情况明显减慢，且差异具有统计学意义（P<0.01）；HIF-1αsiRNA NC组与乙醛刺激组比较， OD值差异无统计学意义（P均>0.05）。
　　2采用 RT-qPCR法检测 HIF-1α、α-SMA和 CollagenⅠ基因相对于β-action内参基因表达变化：正常对照组HSC-T6细胞中HIF-1α、α-SMA和 CollagenⅠ的表达均较少；乙醛刺激组与正常对照组比较，HIF-1α、α-SMA和CollagenⅠ表达量明显增多（P均<0.01）；敲低HIF-1α基因， HIF-1α siRNA组与乙醛刺激组比较，HIF-1α表达降低的同时α-SMA和CollagenⅠ表达明显减少（P均<0.01）；HIF-1αsiRNA NC组和乙醛刺激组比较，各个指标表达的变化，差异均无统计学意义（P均>0.05）。
　　3通过 Western blot法检测 HIF-1αsiRNA转染后 HSC-T6细胞中的HIF-1α、α-SMA和CollagenⅠ蛋白水平表达变化：乙醛刺激组HIF-1α、α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达量明显增多，乙醛刺激组与正常对照组比较差异有统计学意义（P均<0.01）；转染HIF-1αsiRNA48h后，HIF-1α蛋白表达降低，与乙醛刺激组比较差异具有统计学意义（P<0.01），且α-SMA和CollagenⅠ蛋白的表达量也减低；HIF-1αsiRNA NC组与乙醛刺激组比较，各个指标表达变化，差异均无统计学意义（P均>0.05）。
　　4免疫荧光染色法观察大鼠HSC-T6细胞中α-SMA蛋白表达情况：可观察到正常对照组细胞表达少量α-SMA；乙醛刺激组细胞α-SMA蛋白表达增多；转染HIF-1αsiRNA48h后，细胞中的α-SMA蛋白表达减少。
　　结论：
　　乙醛能够促进肝星状细胞增殖活化，敲低HIF-1α对肝星状细胞的增殖活化有抑制作用，可能是酒精性肝纤维化的潜在治疗靶点。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:低氧诱导因子-1调控的肝星状细胞在酒精性肝纤维化中的作用机制

致谢

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