弓形虫感染的人包皮成纤维细胞microRNAs差异表达研究

摘要

刚地弓形虫可以寄生于几乎所有温血动物的有核细胞内，其感染所致的弓形虫病是世界范围流行的严重机会致病性寄生虫病。人类对弓形虫普遍易感，免疫缺陷患者、癌症患者、孕妇感染弓形虫后可导致严重后果。弓形虫感染可诱导宿主细胞的miRNA差异表达，microRNA基因芯片能高通量检测组织和细胞中已知microRNAs表达。因此本研究用microRNA基因芯片分析弓形虫感染前后的人包皮成纤维细胞的microRNA差异表达谱，并用实时荧光定量PCR和Northern杂交验证芯片结果；该实验为进一步研究差异表达的microRNA的功能奠定了一定的基础。 目的： 研究弓形虫感染后的人包皮成纤维细胞microRNA的差异表达，为进一步研究差异表达的microRNA在人包皮成纤维细胞抗弓形虫感染的功能研究提供基础。 方法： 1.弓形虫感染人包皮成纤维细胞的制备。 2.microRNAs基因芯片分析弓形虫感染前后的人包皮成纤维细胞micoRNA差异表达谱。 3.实时荧光定量PCR验证弓形虫感染的人包皮成纤维细胞差异表达micr-oRNA。 4.Northern杂交验证弓形虫感染的人包皮成纤维细胞差异表达microRNA。 结果： 1.体外培养人包皮成纤维细胞生长状态良好，成功制备弓形虫RH株速殖子感染的人包皮成纤维细胞。 2.microRNAs基因芯片分析获得了弓形虫感染24h后人包皮成纤维细胞的microRNA差异表达谱。其中表达量1倍以上上调的microRNA45种，表达量1倍以上下调的microRNA37种。 3.实时荧光定量PCR验证了弓形虫感染24h后的人包皮成纤维细胞的miR-NA-17、miRNA-324-5p上调，而miRNA-18b、miRNA-19b、miRNA-22、miR-NA-24、miRNA-25下调。 4.Northern-blot进一步验证了弓形虫感染24h后的人包皮成纤维细胞的miR-NA-17、miRNA-324-5p上调，miRNA-24、miRNA-25下调，与实时荧光定量PCR验证结果相符。 结论： 本实验通过microRNAs基因芯片高通量分析了弓形虫感染24h后的人包皮成纤维细胞microRNA的差异表达谱，结合实时荧光定量PCR和Northern杂交成功发现了弓形虫感染诱导了人包皮成纤维细胞的miRNA-17、miRNA-324-5p上调，miRNA-24、miRNA-25下调。为进一步研究这些microRNAs在弓形虫和宿主细胞-人包皮成纤维细胞相互作用的调控机制奠定了基础。