咖啡因对左旋多巴诱发的异动症小鼠纹状体谷氨酸脱羧酶65表达的影响

摘要

目的： 左旋多巴(levodopa，L-dopa)是帕金森病(Parkinson’s disease，PD)最有效的症状性治疗药物，但长期应用后大部分患者会出现难以克服的副作用-异动症、(levodopa-induced dyskinesia，LID)，目前LID的发生机制尚未完全阐明。本研究旨在观察腺苷A2A受体非选择性拮抗剂咖啡因对小鼠异动症的影响及纹状体内谷氨酸脱羧酶65(Glutamate decarboxylase，GAD65)的表达变化，探讨腺苷A2A受体和(或)GAD65在LID发生中的作用。 方法： C57B1/6小鼠60只，随机分为6组：①对照组(n=10)；②咖啡因干预的对照组(n=10)；③PD组(n=10)；④咖啡因干预的PD组(n=10)；⑤LID组(n=10)；⑥咖啡因干预的LID组(n=10)。6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)立体定位注射入③④⑤⑥组小鼠左侧纹状体，建立单侧毁损PD小鼠模型。①②组小鼠脑立体定位注射生理盐水作为对照。在手术后第7天，腹腔注射0.5mg/kg阿朴吗啡(apomorphine，Apo)诱导小鼠产生毁损对侧旋转运动(apomorphine-induced rotation，AIR)。对侧净旋转次数≥8次/分，筛选为成功的PD动物模型。术后第十天分别开始对每组小鼠按顺序每隔10分钟腹腔注射以下药物：①生理盐水+苄丝肼(2mg/kg)+生理盐水；②咖啡因(3mg/kg)+苄丝肼(2mg/kg)+生理盐水；③生理盐水+苄丝肼(2mg/kg)+生理盐水；④咖啡因+(3mg/kg)+苄丝肼(2mg/kg)+生理盐水；⑤生理盐水+苄丝肼(2mg/kg)+L-dopa(2mg/kg)；⑥咖啡因(3mg/kg)+苄丝肼(2mg/kg)+L-doap(2mg/kg)。连续注射21天，从第二天开始，隔天一次在L-dopa注射后立即对各组小鼠进行行为学评估。第22天处死老鼠，每组小鼠分为两部分分别取材，用免疫组化和荧光定量PCR(realtime fluores-cence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)技术检测毁损测纹状体GAD65的表达。 结果： (1)咖啡因干预的LID组小鼠对侧净旋转次数小于LID组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。两组小鼠腹腔注射L-dopa后达到旋转高峰的时间相似，其余各组小鼠并未出现明显的对侧旋转运动。 (2)免疫组化结果显示，各组小鼠毁损侧纹状体内GAD65均呈阳性表达，DAB染色后阳性细胞染色清晰，着色良好。PD组及LID组阳性细胞表达量较对照组都升高，差异都具有统计学意义(P<0.05)，LID组较PD组也升高，差异有统计学意义(P<0.05)。咖啡因干预的LID组较LID组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。 (3)RTFQ-PCR结果显示，PD组及LID组mRNA水平较对照组均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，LID组较PD组mRAN水平也升高，差异有统计学意义(P<0.05)。咖啡因干预的LID组较LID组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论： 长期间断给予L-dopa刺激，可诱导PD小鼠出现LID。咖啡因与L-dopa合用可减轻小鼠LID的症状，可能与阻断腺苷A2A受体，减少纹状体GAD65的表达，从而影响纹状体黑质神经元的活性，降低直接通路的兴奋性有关。