衰老过程中线粒体顺乌头酸酶活性调节及相关线粒体能量代谢研究

摘要

目的：
　　利用不同月龄的大鼠，研究在衰老过程中线粒体顺乌头酸酶(mitochondrialaconitase，m-aconitase，AC02)对线粒体能量代谢的影响及其机制。
　　对象与方法：
　　1.选用不同月龄(1月，8月，16月，24月)的SD雄性大鼠为实验动物，以大鼠脑组织AC02为研究对象。
　　2.蔗糖密度梯度离心法分离高纯度大鼠脑组织线粒体。ACO2活性的检测是通过340nm处吸光度测定在柠檬酸转变成α-酮戊二酸的反应过程中NADPH生成的量，从而间接表示顺乌头酸酶活性的大小。检测不同月龄大鼠脑组织ACO2活性，并用Western Blot和Real Time PCR检该酶表达水平。
　　3.利用H2O2的强氧化能力，在体外模拟体内的氧化损伤。用H2O2处理所提取的线粒体，分别比较不同浓度(0μM，50μM，50μM，100μM，200μM，400μM)的H2O2及不同处理时间(0min，30min，1h，2h)的顺乌头酸酶活性变化。
　　4.测定不同月龄大鼠脑组织非血红素铁含量。在酸性条件下，铁从转铁蛋白上游离出来，并沉淀蛋白。上清中的三价铁被还原为二价铁，亚铁离子与菲咯嗪反应形成紫色复合物。在562 nm处测其吸光度，通过标准曲线计算铁含量。
　　5.利用透射电镜观察线粒体在衰老中的形态变化。通过检测线粒体膜电位和能量合成研究线粒体在衰老过程中的功能变化。用荧光探针JC-1标记线粒体，分光光度计检测线粒体膜电位的变化情况。用高效液相色谱法检测脑组织ATP、ADP、AMP含量并计算能荷。
　　结果：
　　1.Western Blot检测结果显示，用蔗糖线性梯度离心法能得到较高纯度的线粒体。ACO2活性随着月龄增加逐渐下降，然而其蛋白表达水平和RNA表达水平在不同月龄间没有明显差异。
　　2.在体外氧化压力作用下，ACO2活性与H2O2的处理浓度和时间呈负相关。
　　3.脑组织非血红素铁的含量在衰老过程中逐渐积累。
　　4.衰老大鼠线粒体形态发生改变，结构出现不同程度损伤。在衰老过程中，线粒体膜电位降低，ATP合成量与能荷呈明显下降趋势。
　　结论：
　　1.ACO2活性中心的[4Fe-4S]2+，易受ROS攻击而失活。本研究中，H2O2处理后所致的ACO2酶活下降证明了该结论。对不同月龄大鼠ACO2检测结果证明衰老过程中，机体ROS日益增多，ACO2遭受氧化压力加重，导致酶活性增龄性递减。此外，衰老过程中ACO2活性的降低并非其蛋白和基因表达降低，可能是其蛋白结构域受影响而造成该酶的功能缺失。
　　2.衰老过程中伴随着铁的积累。衰老过程中产生的过氧化物使铁蛋白上的铁游离出来，使得组织铁含量升高。此外，释放的Fe经过Fenton反应促使更多的ROS产生，加重氧化损伤。
　　3.衰老大鼠线粒体形态不如年轻组规则，出现明显的肿胀和空泡，双膜解体，嵴不清楚，甚至消失，说明衰老组线粒体结构可能有不同程度损伤。线粒体膜电位和脑组织能荷都随着衰老进程逐渐降低。ACO2活性降低可能影响TCA循环的整体效率，使得能量合成降低，此外，还可能引起还原当量(NADH)减少，导致线粒体膜电位下降。线粒体膜电位下降是导致氧化磷酸化效率下降的原因之一，也会造成线粒体的能量合成受阻。
　　4.衰老过程中，ACO2活性与线粒体能量代谢的相关性研究对我们更多第了解衰老机制，以及探求老化过程中或在神经退行性疾病初期阶段线粒体功能损伤的发病机理，揭示认知退化的发病机制，从而找到更好的治疗策略有着重要的意义。

目录

文摘

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材料与方法

结 果

分析与讨论

参考文献

致谢

综述及参考文献

参考文献