消退素D1对内毒素性肺损伤大鼠肺泡液体清除的影响和机制

摘要

本研究分为四部分。
　　 第一部分 消退素D1对内毒素致大鼠急性肺损伤模型肺泡液体清除率的影响
　　 目的:
　　 建立大鼠内毒素性急性肺损伤模型，探讨消退素D1对急性肺损伤大鼠肺泡液体清除的效应和对ALI的保护效应
　　 方法:
　　 40只清洁级SD大鼠，随机分成5组:正常对照组（实验开始8小时后尾静脉注射生理盐水，control组）、消退素D1对照组（实验开始8小时后尾静脉注射消退素D15ug/kg，resolvin D1组），前两组为非急性肺损伤(ALI)组;急性肺损伤组（实验开始时尾静脉注射内毒素LPS20mg/kg，LPS组）、溶剂对照组（实验开始时尾静脉注射内毒素LPS20mg/kg后8小时，再尾静脉注射乙醇溶剂约15ul/ml，LPS+alcohol组）消退素D1治疗组（实验开始时尾静脉注射内毒素LPS20mg/kg后8小时，再尾静脉注射消退素D15ug/kg，LPS+resolvin D1组），后三组为急性肺损伤(ALI)组。5组大鼠尾静脉注入生理盐水及内毒素8h后，尾静脉注射消退素D1作为干预措施，气管切开进行气管插管，接小动物呼吸机，行容量控制通气。机械通气参数如下:潮气量2.8±0.2ml，呼吸末正压2-3cmH20(1 cmH20=0.098KPa)呼吸频率45-50次/分，呼吸比1∶4。吸入氧浓度100％。吸纯氧10min后，测定大鼠肺泡液体清除率(AFC)，方法如下:按照5ml/kg抽取Evans蓝标记的5％牛血清白蛋白灌注液，将灌注液于0.08ml/min匀速注入大鼠的左肺内，连接呼吸机，机械通气持续1h后，腹主动脉横断处死大鼠，完整取出气管、肺和心脏，回抽肺泡灌注液，用酶标仪在波长620nm处测定Evans蓝标记的白蛋白浓度来测定不同组大鼠的肺泡液体清除率(AFC)。AFC的计算公式如下:AFC=(1-C0/C1)×100，C0是灌注之前白蛋白的吸光度值，C1是灌注后呼吸机通气1h回抽的白蛋白吸光度值。光镜下观察大鼠肺组织的病理学改变，进行急性肺损伤评分。
　　 结果:
　　 (1)与空白对照组比较，LPS组和溶剂对照(LPS+alcohol)组大鼠AFC明显降低(P＜0.01)，消退素D1组大鼠AFC无显著改变;与内毒素组比较，消退素D1治疗(LPS+resolvin D1)组大鼠AFC明显升高(P＜0.01)，非ALI组，消退素D1对肺泡液体清除率(AFC)的影响并无差异。
　　 (2)空白对照组和消退素D1组大鼠肺组织结构完整，肺泡间隔正常，无炎性细胞浸润;LPS组大鼠肺组织结构破坏明显，肺组织内大量炎症细胞浸润，肺泡壁明显充血、水肿;消退素D1组治疗(LPS+resolvin D1)组大鼠肺组织有炎性细胞浸润，肺泡壁充血、水肿程度轻于LPS组。与空白对照组比较，消退素D1组肺损伤评分没有显著差异(P＞0.05)，而LPS组和LPS+resolvin D1组大鼠肺组织急性肺损伤评分明显升高（均P＜0.01）;与LPS组比较，LPS+resolvin D1组大鼠肺组织急性肺损伤评分明显降低(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 在内毒素致急性肺损伤大鼠模型中，消退素D1能够增加肺泡液体清除率(AFC)，同时减轻急性肺损伤的炎症细胞浸润、肺泡壁充血、水肿程度。
　　 第二部分 消退素D1对上皮钠通道和钠钾ATP酶蛋白以及其活性的影响
　　 目的:
　　 探讨消退素D1对内毒素致急性肺损伤大鼠肺泡液体清除率的影响是否通过调控肺泡上皮钠水主动转运系统中钠通道和钠钾ATP酶表达，以及钠钾ATP酶活性来完成。
　　 方法:
　　 40只清洁级SD大鼠，体重在250g-300g之间，随机分成5组:正常对照组（实验开始8小时后尾静脉注射生理盐水，control组）、消退素D1对照组（实验开始8小时后尾静脉注射消退素D15ug/kg，resolvin D1组），前两组为非ALI组;急性肺损伤组（实验开始时尾静脉注射内毒素20mg/kg，LPS组）、溶剂对照组（实验开始时尾静脉注射内毒素20mg/kg后8小时，再尾静脉注射乙醇溶剂15ul/ml，LPS+alcohol组）、消退素D1治疗组（实验开始时尾静脉注射内毒素20mg/kg后8小时，再尾静脉注射消退素D15ug/kg，LPS+resolvin D1组），后三组为ALI组。大鼠尾静脉注内毒素8h后，尾静脉注射消退素D1作为干预，气管切开进行气管插管，接小动物呼吸机，机械通气持续1h后，腹主动脉横断处死大鼠，取出肺组织，采用免疫印迹(Western Bloting)分析法检测肺组织ENaC和Na-K-ATPase蛋白的表达。肺组织Na-K-ATPase活性检测按南京建成生物工程研究所提供微量钠钾ATP酶试剂盒的说明书进行。
　　 结果:
　　 (1)与空白对照组比较，LPS组αγ-ENaC(P＜0.05)和LPS+alcohol组α-ENaC(P＜0.05)和γ-ENaC(P＜0.01)蛋白表达明显降低;与LPS组比较，LPS+resolvin D1(5ug/kg)组αγ-ENaC蛋白表达明显升高(P＜0.05)。
　　 (2)与空白对照组比较，LPS组和LPS+alcohol组αβ-Na-K-ATPase蛋白表达均明显降低(P＜0.05);与LPS组比较，LPS+resolvin D1(5ug/kg)组α-Na-K-ATPase(P＜0.05)和β-Na-K-ATPase(P＜0.01)蛋白表达明显升高。
　　 (3)与空白对照组比较，LPS组和LPS+alcohol组Na-K-ATPase活性明显降低(P＜0.01)，与LPS组比较，LPS+resolvin D1(5ug/kg)组Na-K-ATPase活性明显增加(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 消退素D1能够增加内毒素致急性肺损伤大鼠模型中肺泡液体清除率(AFC)，可能是通过上调αγ-ENaC和αβ-Na-K-ATPase蛋白表达，增加Na-K-ATPase活性来完成。
　　 第三部分 消退素D1对内毒素攻击大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞钠通道和钠钾ATP酶蛋白表达以及其活性的影响
　　 目的:
　　 探讨消退素D1对大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞钠通道和钠钾ATP酶蛋白表达以及其活性的影响。
　　 方法:
　　 用胰酶消化、免疫和差时贴壁法分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，将细胞随机分成5组:①正常对照组（control，培养基不加任何药物），②内毒素组(LPS，1 ug/ml)，(③溶剂对照组(1 ug/ml LPS+0.19 ul/ml alcohol)，④内毒素+消退素D1组(lug/ml LPS+50 nmol/ml resolvinD1)⑤消退素D1组(resolvinD1，50nmol/ml)。药物干预12后用蛋白印迹方法检测αβγ-ENaC和αβ-Na-K-ATPase蛋白的表达。Na-K-ATPase活性检测按南京建成生物工程研究所提供微量钠钾ATP酶试剂盒的说明书进行。
　　 结果:
　　 (1)与空白对照组比较，LPS组和LPS+alcohol组αγ-ENaC蛋白表达明显降低（P＜0.01），LPS+resolvin D1组和resolvin D1组α-ENaC蛋白表达降低(P＜0.05);与LPS组比较，LPS+resolvin D1(50 nmol/ml)组αγ-ENaC蛋白表达明显升高（P＜0.01）。
　　 (2)与空白对照组比较，LPS组和LPS+alcohol组α-Na-K-ATPase蛋白表达明显降低（P＜0.05），与LPS组比较，LPS+resolvin D1(50 nmol/ml)组α-Na-K-ATPase(P＜0.05)和resolvin D1(50 nmol/ml)组α-Na-K-ATPase(P＜0.01)蛋白表达明显升高。
　　 (3)与空白对照组比较，LPS组和LPS+alcohol组Na-K-ATPase活性明显降低(P＜0.01)，与LPS组比较，LPS+resolvin D1(50 nmol/ml)组Na-K-ATPase活性明显增加(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 消退素D1可上调LPS攻击的大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞αγ-ENaC和α-Na-K-ATPase蛋白表达，以及增加Na-K-ATPase活性。
　　 第四部分 消退素D1对LPS致ALI大鼠肺cAMP和cGMP表达的影响
　　 目的:
　　 探讨LPS致ALI大鼠模型肺组织，消退素D1调控钠通道和钠钾ATP酶的机制
　　 方法:
　　 40只清洁级SD大鼠，体重在250g-300g之间，随机分成5组:正常对照组（实验开始8小时后尾静脉注射生理盐水，control组）、消退素D1对照组（实验开始8小时后尾静脉注射消退素D15 ug/kg，resolvin D1组），前两组为非ALI组;急性肺损伤组（实验开始时尾静脉注射内毒素20 mg/kg，LPS组）、溶剂对照组（实验开始时尾静脉注射内毒素20mg/kg后8小时，再尾静脉注射乙醇溶剂，LPS+alcohol组）、消退素D1治疗组（实验开始时尾静脉注射内毒素20mg/kg后8小时，再尾静脉注射消退素D15 ug/kg，LPS+resolvin D1组），后三组为ALI组。大鼠尾静脉注内毒素8h后，尾静脉注射消退素D1作为干预措施，气管切开进行气管插管，接小动物呼吸机，机械通气持续1h后，腹主动脉横断处死大鼠，称取肺组织匀浆，ELISA检测大鼠肺组织cAMP和cGMP含量。
　　 结果:
　　 各组cAMP和cGMP水平并没有明显变化。
　　 结论:
　　 LPS致ALI大鼠模型中，消退素D1可能不通过cAMP和cGMP介导调控钠通道和钠钾ATP酶蛋白表达以及钠钾ATP酶活性。

目录

摘要

前言

实验材料和方法

第一部分 消退素D1对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤大鼠肺泡液体清除率的影响

第二部分 消退素D1对上皮钠离子通道和钠钾ATP酶蛋白以及其活性的影响

第三部分 消退素D1对原代肺泡Ⅱ型上皮细胞ENac和Na-K-ATPase蛋白表达以及Na-K-ATPase活性的影响

第四部分 消退素D1对LPS致大鼠肺cAMP和cGMP表达的影响检测肺组织中cAMP、cGMP水平

结果

第一部分 消退素D1对内毒素致大鼠急性肺损伤模型肺泡液体清除率的影响

第二部分 消退素D1对上皮钠通道和钠钾ATP酶蛋白以及其活性的影响

第三部分 消退素D1对内毒素攻击大鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)钠通道和钠钾ATP酶蛋白表达以及其活性的影响

第四部分 消退素D1对LPS致ALI大鼠肺cAMP和cGMP表达的影响

讨论

结论

参考文献

附录 缩略词表

致谢

在校期间科研及发表论文情况

综述 腺苷受体对急性肺损伤肺泡液体清除和肺部炎症的影响

声明