一个参与拟南芥镉胁迫响应调节基因的克隆及其表达模式分析

摘要

土壤重金属镉污染严重影响植物的生长和发育，不仅会造成农业减产，而且会引发食品安全问题。通过植物修复技术和基因工程方法降低农作物可食部位的镉积累是解决土壤镉污染及食品安全的技术途径之一。然而，这项工作的关键在于对植物耐受镉毒害及其积累调控的分子机理的认识以及关键基因的发掘。　　本研究从化学诱导激活标签系统构建的拟南芥突变体库中筛选了一个对镉胁迫耐受的突变体wew1-D，并对其进行了研究，获得了如下结果：　　1.在β-雌二醇诱导下，vew1-D突变体对镉胁迫的耐受性较野生型显著增加，但在重金属铅及氧化胁迫下，vew1-D突变体和野生型无显著性差异。　　2.利用Tail-PCR的方法克隆VEW1基因，其编码一个功能未知的WRKY转录因子。通过不同浓度的β-雌二醇短期诱导该突变体，发现VEW1的转录水平随着β-雌二醇浓度的增加而提高。　　3.通过对VEW1进行氨基酸序列分析，发现VEW1基因与水稻(Oryzasativa)中的相关基因具有高度的相似性。而在葡萄、甜瓜、大豆和蓖麻中也发现类似基因。　　4.vew1-D突变体植株的地上及根部重金属镉含量较野生型显著降低。　　5.在重金属镉短期诱导下，通过对野生型植株的VEW1和一个编码特异性镉离子泵的基因AtPDR8转录水平的检测后发现，随着VEW1转录水平的增加，AtPDR8的转录水平也随之提高，表明AtPDR8可能受WRLKY转录因子VEW1转录调控。由于VEW1基因编码一个WRKY家族的转录因子，其专一识别序列是(T)(T)TGAC(C/T)，片段(W-box)，而通过数据库查询发现AtPDR8基因启动子区有11个W-box。由此推测：WRKY转录因子VEW1可能与AtPDR8的W-box结合，激活了编码镉离子泵的基因AtPDR8的表达，从而将胞内镉离子泵至胞外，进而降低了胞内镉含量而导致植株对镉的耐受性增强。　　总之，所有这些结果表明，VEW1基因在调控重金属镉(Cd)胁迫响应过程中起着重要的作用。

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表格清单

第一部分 绪 论

1.1 拟南芥概述

1.2 常见非生物逆境及植物抗逆特性

1.2.1 重金属污染现状

1.2.2 重金属进入植物体的途径

1.2.3 重金属胁迫对植物的损伤

1.2.4 植物对重金属胁迫的响应及其机理

1.3 拟南芥抗重金属研究现状

1.4 本研究的目的及意义

第一部分 绪 论

2.1 实验材料

2.2 常用药品、生化试剂、菌株和质粒

2.2.1 常用药品

2.2.2 生化试剂

2.2.3 菌株和质粒

2.3 培养基

2.3.1 MS培养基

2.3.2 LB培养基

2.4 仪器设备

2.5 实验方法

2.5.1 拟南芥土壤培养方法

2.5.2 拟南芥培养皿培养法

2.5.3 拟南芥组织中的金属镉含量测定

2.5.4 CTAB法提取拟南芥基因组DNA

2.5.5 Trizol法提取拟南芥总RNA

2.5.6 RT法合成全基因组cDNA

2.5.7 PCR反应

2.5.8 热不对称交错PCR(Tail-PCR)

2.5.9 琼脂糖凝胶电泳

2.5.10 PCR产物的回收纯化

2.5.11 大肠杆菌DH5a的菌株活化与感受态的制备及转化

2.5.12 植物表达载体构建

2.5.13 质粒抽提

2.5.14 酶切目的片段和酶切载体的T4连接反应

2.5.15 农杆菌GV3101活化、感受态的制备与转化

2.5.16 浸花法转化拟南芥

2.5.17 引物信息

2.5.18 数据统计与分析

第三部分 实验结果与分析

3.1 vew1-D突变体对重金属镉胁迫的响应

3.1.1 vew1-D突变体在重金属镉胁迫下的表型

3.1.2 vew-D突变体在重金属镉胁迫下根长与鲜重的变化

3.2 vew1-D突变体对重金属铅胁迫的响应

3.3 vew1-D突变体目的基因的克隆及测序比对

3.3.1 cew1-D突变体目的基因的克隆

3.3.2 vew1-D突变体目的基因的测序比对

3.4 VEW1基因插入位点分析

3.5 VEW1基因的初步确认

3.6 VEW1基因的过量表达

3.7 VEW1基因结构分析

3.7.1 VEW1基因同源性分析

3.7.2 VEW1基因氨基酸序列比对

3.8 VEW1基因的亚细胞定位

3.9 VEW1基因表达模式

3.9.1 VEW1基因组织特异性表达

3.9.2 VEW1基因的GUS染色

3.10 VEW1基因诱导表达

3.11 vew1-D突变体在重金属镉胁迫下镉含量的变化

第四部分 讨论与展望

4.1 讨论

4.2 展望

参考文献