金黄色葡萄球菌saeRS和agr对其分泌蛋白及毒力的影响

摘要

目的：金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，可以引起许多临床表现不同的感染性疾病。它所致感染的多样性和严重度取决于不同毒力因子的协同表达，而这些数量众多的毒力因子的表达会受到不同调节系统的控制，同时这些调节系统之间也存在着复杂的相互作用关系。金黄色葡萄球菌可以产生多种毒力因子，其中杀白细胞素(Panton-Valentine Leukocidin，PVL)是社区获得性金黄色葡萄球菌(community-acquired MRSA，CA-MRSA)的重要毒力因子，PVL的致病作用近些年受到广泛关注。金黄色葡萄球中的葡萄球菌附属基因调节子(accessory generegulator, agr)和SaeRS(Staphylococcus aureus exoprotein expression)双组分信号转导系统，在调节金黄色葡萄球菌毒力因子的协同表达上起着重要作用。为了深入研究agr系统和SaeRS双组分信号转导系统对金黄色葡萄球菌分泌蛋白及毒力的影响，我们在前期成功构建的一株临床分离金黄色葡萄球菌的agr缺失突变株的基础上，又利用同源重组技术，构建了saeRS敲除突变株及saeRS、agr双敲除突变株，并对其相关功能做了初步研究。
　　 方法：用PCR扩增金黄色葡萄球菌SA75的saeRS基因上下游同源臂，构建同源重组质粒pKOR1-△saeRS，将质粒电转入金黄色葡萄球菌RN4220中进行修饰，再电转入金黄色葡萄球菌和agr基因敲除突变株中。将含有重组质粒的金黄色葡萄球菌和agr基因敲除突变株经一系列变温传代培养，使用脱水四环素筛选saeRS缺失可疑突变株，对筛选到的可疑突变株用PCR和基因测序进行确认。确认构建成功后，使用Triton X-100检测野生株和突变株间的自溶能力，应用SDS-PAGE检测基因敲除前后金黄色葡萄球菌(SA75)分泌蛋白的变化，使用血平板法检测野生株和基因敲除株间溶血能力的改变，使用RT-PCR检测saeRS及agr基因对金黄色萄球菌(SA75)hla、hlb、luks-PV和spa基因表达的影响。
　　 结果：金黄色葡萄球菌于2010年2月分离自温州医学院附属第一医院一皮肤软组织化脓性感染患者的脓液标本，经革兰染色、血浆凝固酶实验及全自动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌。经PCR证实agr、saeRS基因阳性，lukS-PV基因阳性;将saeRS基因上游片断的PCR产物(1000bp)、saeRS基因下游片断的PCR产物(1000bp)两者连接后插入质粒pKOR1，成功构建pKOR1-△saeRS。同源重组质粒pKOR1-△saeRS先被电转入金黄色葡萄球菌RN4220进行修饰，然后再电转入金黄色葡萄球菌SA75和SA75△agr基因敲除突变株中。提高已转入pKOR1-△saeRS的金黄色葡萄球菌的培养温度(42℃)，之后降温进行培养(30℃)，促进同源重组的发生，利用脱水四环素的诱导凋亡进行筛选，获得疑似突变株。在saeRS基因上游片段的上游和下游片段的下游各设计一条引物，以突变株的染色体基因组DNA为模板进行扩增，得到的片段比野生株SA75基因组DNA为模板扩增得到的片段要少1724 bp。将扩增得到的产物进行测序分析，确认敲除突变株构建成功。在构建完各突变株后，我们分析了SA75株和突变株SA75△saeRS、SA75△agr和SA75△saeRS△agr在生长曲线、自溶能力、生化特性、分泌蛋白、溶血能力和蛋白水解能力等方面的差异。发现和SA75相比，各基因敲除突变株的生长，自溶能力和生化特性并无别大的差异，仅SA75△agr和SA75△saeRS△agr在平台后期生长有所增快，在生化特性上SA75△agr和SA75△saeRS△agr基因敲除株有较大的改变。在分泌蛋白上，我们发现和野生株相比，各突变株分泌蛋白的量和种类都有明显的减少，尤其是SA75△saeRS△agr株，说明saeRS和agr是调控金黄色葡萄球菌外分泌蛋白的重要因子，但是就其具体调控哪些分泌蛋白还需要进一步的研究。在溶血能力的检测上，我们发现与野生株SA75相比，各基因敲除突变株溶血圈的直径明显减小，溶血圈也没有野生株那么透明，而SA75△saeRS△agr未见有溶血圈的产生。说明saeRS和agr也是调控金黄色葡萄球菌溶血毒素表达的重要调控因子。在水解蛋白能力上，我们发现SA75△saeRS和野生株SA75没有发现蛋白水解圈的产生，而SA75△agr和SA75△saeRS△agr在孵育了6h后发现有明显的蛋白水解圈的产生，且其水解圈直径相当。说明在金黄色葡萄球菌中agr基因缺失后，其蛋白水解能力增强。通过RT-PCR技术，我们发现在敲除突变株中一些毒力因子基因，包括hla和luks-PV基因的转录水平在3h、6h和10h各个时间点上都有明显的下降。
　　 结论：
　　 1.成功构建了saeRS基因和saeRS、agr基因双敲除突变株，为研究他们的功能奠定基础。
　　 2.SaeRS和agr是调节金黄色葡萄球菌分泌蛋白的关键因子。SaeRS和agr对金黄色葡萄球菌通过上调hla表达从而增加溶血能力以及上调lukS-PV基因的表达，增加细菌的毒力。

目录

缩略表

摘要

前言

第一节：金黄色葡萄球菌(SA75)saeRS基因和saeRS、agr双基因敲除突变株的构建

材料和方法

结果

讨论

第二节 金黄色葡萄球菌SA75 △ saeRS、SA75 △ agr和SA75 △ saeRS △ agr双基因敲除突变株表型的研究

材料和方法

结果

讨论

论文总结

参考文献

附录

致谢

综述 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力的研究进展

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