WISP1表达与食管鳞状细胞癌患者临床病理表现的相关性研究

摘要

背景和目的:
　　 2008年的研究表明，全世界食管癌发病率位居第八，死亡率位居第六;在我国则分别位居第五和第四。尽管食管癌的诊断和治疗已经取得许多进步，但是发现时通常已是局部晚期，并可能转移至其它器官，导致预后不良。晚期或转移食管癌患者通常对综合治疗表现出抵抗性，包括化学治疗、放射治疗甚至生物治疗，因此食管癌是一种常见的低治愈率恶性肿瘤。为了进一步了解食管癌发生发展机制，开发更佳诊断和治疗策略，有必要从临床病理学及分子水平进一步探索。
　　 WISP1是Cyr61-CTGF-Nov(CCN)生长因子家族的成员之一，在比较大鼠高转移性和低转移性黑色素瘤细胞进行RNA表达水平时首次发现。CCN生长因子家族包括半胧氨酸富集蛋白(Cyr61/CCN1)，结缔组织生长因子(CTGF/CCN2)和肾母细胞瘤过度表达基因(Nov/CCN3)，WISP1/CCN4/Elm1，WISP2/CCN5/rCop-1和WISP3/CCN6。他们是分泌型细胞外基质相关蛋白，结构相似，功能广泛各异，包括细胞黏附、分裂、迁移和趋化、细胞存活、分化、软骨形成、骨修复、血管生成及肿瘤发生。
　　 WISP1是Wnt(Wingless/int-1)/β-catenin通路的下游关键靶基因。Wnt/β-catenin通路是由Wnt受体激活的三条通路中研究最为彻底的，Wnt已经被证明与人类退行性疾病及肿瘤存在密切关系。Wnt基因最初在乳腺癌中被认为是乳腺癌病毒诱导的癌前基因。Wnt-1是Wnt配体，在食管鳞状细胞癌(ESCC)及头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中具有转录及细胞生长的作用。WISP1（Wnt诱导的分泌蛋白1）基因位于染色体8q24.1～8q24.3，长度为211 bp，原始mRNA长4.5 kb，包含5个外显子，4个内含子，第1个外显子编码信号肽，其余编码4个不同的功能结构域[1，5，6]。WISP-1在人类多种组织器官中广泛表达，具有促进细胞增殖和细胞外基质沉积、介导细胞黏附、刺激细胞迁移等生物学功能，WISP1通过旁分泌-自分泌的方式导致肿瘤的发生，目前已在多种肿瘤中检测WISP1蛋白并呈现不同表达水平。一些研究提示WISP1的表达水平可能与某些临床表现具有一定的相关性。NAGAI等研究了105例食管鳞状细胞癌患者，WISP1表达与某些临床病理学特征显著相关。为进一步论证WISP1在食管鳞状细胞癌发生发展中的潜在作用，本研究对食管鳞状细胞癌患者临床病理学表现与WISP1表达的相关性进行研究。
　　 患者和方法:
　　 组织样本:本研究收集2005-2009年在温州医学院附属第一医院159例胸段食管鳞状细胞癌手术患者组织样本，所有患者术前均未接受包括化学治疗、放射治疗等治疗。常规苏木精-伊红染色及病理诊断在本院病理科完成。酒精固定、石蜡包埋切片层厚为4μm，免疫组织化学染色并组织病理学诊断为食管鳞状细胞癌。每例患者包括如下信息:年龄、性别、临床病理学分期(TNM system，7th Edition of the AJCC Cancer StagingManual，2009)、肿瘤部位、浸润深度、局部淋巴结转移、远处转移。随访截止2012年12月31日。
　　 免疫组织化学染色:使用人类WISP1兔多克隆抗体按1∶50稀释(Abcam，Cambridge，USA)对石蜡包埋组织切片染色。标准兔Ig G作为阴性对照。二抗为PV-6000通用二步法免疫组织化学检测试剂(ZSGB-BIO， Peking， China)。免疫组织化学染色步骤如下:1）70度烤箱2-3h，二甲苯脱蜡15min、梯度酒精水化组织切片（100-95-85-75％每次3min）。2)0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)煮沸后放入1.5min复苏抗原。3％H2O2去离子水（30％母液甲醇或水稀释）封闭10min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗。3）滴加一抗(1∶50)，4℃过夜。滴加二抗，37℃孵育15min，每次孵育均PBS冲洗5分钟×3次。4）应用DAB溶液显色2-5min，蒸馏水冲洗、苏木素复染30s、梯度酒精(75-85-95-100％)脱水、二甲苯透明、封片。
　　 免疫反应评分:为两条评分标准的乘积，染色强度和着色细胞比例。染色强度:无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。着色细胞比例:0，阴性;1，≤10％;2，11％-50％;3，51％-75％;4，≥75％。免疫反应评分小于6定义为WISP1表达阴性，大于或等于6定义为阳性。所有切片由两名有经验的研究人员独立进行评分
　　 统计分析:计数资料使用卡方检验或Fisher确切概率分析数据。显著性水平定义为P≤0.05。OS为手术日期至随访截止或死亡。Kaplan-Meier法和对数秩检验用于单因素生存分析，多因素生存分析则采用Cox回归。所有的统计分析使用PASW statistics18软件进行。
　　 结果:
　　 1.临床病理学表现与WISP1蛋白表达
　　 所有切片组织病理学诊断为鳞状细胞癌。食管鳞状细胞癌WISP1表达阳性的典型免疫组织化学染色见图1、2。食管癌细胞质染色阳性，呈弥漫性，而细胞基质染色弱;周围的正常鳞状上皮细胞则鲜有WISP1免疫反应现象。
　　 临床病理学表现与WISP1蛋白表达的相关性见表2。159例患者中，WISP1（-）52例，WISP1(+)107例。可见WISP1蛋白表达与肿瘤部位、浸润深度及局部淋巴结转移具有相关性。
　　 ①肿瘤位于上、中、下段的患者分别为10、98、51例，肿瘤部位与WISP1蛋白表达的卡方检验P值=0.002，具有相关性。
　　 ②肿瘤浸润至粘膜、粘膜下层及固有肌层的患者分别为15、53、89例，浸润深度与WISP1蛋白表达的卡方检验P值=0.01，具有相关性。
　　 ③有无局部淋巴结转移的患者分别为99、60例，淋巴结转移与WISP1蛋白表达的卡方检验P值=0.05，具有相关性。
　　 ④有无远处转移的患者分别为36、123例，远处转移与WISP1蛋白表达的卡方检验P值=0.054，无相关性。
　　 ⑤TNM分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的患者分别为25、72、26、36例，TNM分期与WISP1蛋白表达的卡方检验P值=0.083，无相关性。
　　 2.患者特征与WISP1蛋白表达
　　 159例食管鳞状细胞癌患者中，男生139例，女性20例，中位年龄63.05岁，年龄40-83岁，性别与WISP1蛋白表达的卡方检验P值=0.078，无相关性。
　　 3.生存分析
　　 WISP1表达生存曲线见图3。从图中可见，WISP1（-）的患者生存明显优于WISP1(+)的患者(P=0.001)。多因素分析提示提示淋巴结转移、远处转移和WISP1表达是独立的预后因素。
　　 结论:
　　 WISP1蛋白表达阳性的食管癌与肿瘤的部位、浸润深度、局部淋巴结转移具有显著相关性，而与远处转移、TNM分期和性别无显著相关性。淋巴结转移、远处转移和WISP1表达可以提示患者的生存预期。

目录

缩略词表

摘要

引言

材料与方法

组织样本

免疫组织化学染色

免疫反应评分

统计方法

结果

1．临床病理学表现与WISP1蛋白表达

2．患者特征与WISP1蛋白表达

3．生存分析

结论

分析与讨论

参考文献

附录

致谢

综述 WISP1研究进展

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