GITR/GITRL在支气管哮喘大鼠中性粒细胞及肺泡巨噬细胞上的表达

摘要

目的:
　　 GITR/GITRL是一对共刺激分子，反映了体内Treg的数量及功能状况，参与了体内复杂的免疫系统的反应。本实验通过建立大鼠哮喘模型，检测哮喘组、对照组和布地奈德干预组外周血PMN及肺泡巨噬细胞上的GITR/GITRL的表达情况，探讨其与支气管哮喘的关系及糖皮质激素干预后对其表达的影响，为哮喘发病机制的进一步完善及糖皮质激素治疗提供一定的理论依据，并为进一步研究能否通过调节GITR/GITRL信号的共刺激活化途径实现哮喘的目标性免疫调节性治疗提供新的思路。
　　 方法:
　　 清洁级5周龄雄性健康SD大鼠，随机分为哮喘组（A组）、布地奈德干预组（B组）、对照组（C组），每组10只，用OVA制备哮喘模型，C组以生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入，B组在激发阶段予布地奈德混悬液雾化吸入治疗。末次激发24小时后水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取血，结扎左肺留取肺组织，右肺行支气管肺泡灌洗留取BALF。肺组织HE染色观察病理变化;对血标本进行PMN的分离提纯，提取总RNA;计BALF沉渣中细胞总数;对肺泡灌洗液中的肺泡巨噬细胞进行分离、纯化、细胞爬片、提取总RNA;采用免疫细胞化学法测定GITR/GITRL蛋白在肺泡巨噬细胞上的表达;采用实时荧光定量PCR的方法检测GITR/GITRLmRNA在肺泡巨噬细胞及外周血PMN的表达情况。
　　 结果:
　　 1、成功构建大鼠支气管哮喘模型:激发阶段观察到A组大鼠出现呼吸加快、腹部肌肉抽搐、全身发绀等症状，严重者呼吸减慢，节律紊乱，部分典型的大鼠哮喘发作时可闻及明显的哮鸣音。HE染色镜下见A组大鼠小支气管、血管粘膜下和周围的肺组织有明显的炎性浸润，以淋巴细胞、EOS、PMN为主。
　　 2、BALF的细胞数:各组大鼠BALF的回收量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。BALF中的细胞计数结果显示，A组、B组的BALF中细胞总数均高于C组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。B组和C组的细胞总数分别低于A组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。
　　 3、成功分离出外周血PMN:分离到的PMN其数量大于106/ml;瑞氏染色显示，PMN呈圆形，胞质淡红色，部分胞核可见分叶状。
　　 4、成功分离出肺泡巨噬细胞:显微镜下观察分离到的肺泡巨噬细胞呈圆形、透亮，培养40min-50min左右，可观察到肺泡巨噬细胞逐渐贴壁，形状呈现多态性，为圆形、椭圆形或其他不规则形状，胞质较前丰富，2h后细胞贴满培养瓶的底部，细胞呈圆形或星形，有些呈不规则形状，部分细胞可见伪足和突起。
　　 5、实时荧光定量PCR结果: GITR/GITRLmRNA在各组的外周血PMN和肺泡巨噬细胞上均有表达，A组的外周血PMN和肺泡巨噬细胞GITR/GITRLmRNA相对表达水平高于C组和B组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。而B组与C组的外周血PMN和肺泡巨噬细胞GITR/GITRLmRNA相对表达水平相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 6、肺泡巨噬细胞免疫细胞化学结果:各组的肺泡巨噬细胞上GITR/GITRL均有表达，其阳性表达主要在胞膜与胞浆。阴性对照片无棕黄色颗粒，仅见复染的细胞核。A组肺泡巨噬细胞的GITR/GITRL蛋白表达水平高于C和B组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。而B组与C组的肺泡巨噬细胞的GITR/GITRL蛋白表达水平相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 结论:
　　 1、A组大鼠外周血PMN和肺泡巨噬细胞的GITR/GITRL表达高于C组，提示PMN和肺泡巨噬细胞可能部分通过GITR/GITRL信号在哮喘的炎症过程中起到重要的作用。
　　 2、B组大鼠外周血PMN和肺泡巨噬细胞的GITR/GITRL表达低于A组，提示糖皮质激素可能通过抑制PMN和肺泡巨噬细胞上的GITR/GITRL信号发挥治疗哮喘的作用。

目录

缩略词表

摘要

前言

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

一、各组大鼠一般情况比较

二、BALF回收量、BALF中细胞总数比较

三、PMN分离提纯结果

四、肺泡巨噬细胞分离提纯结果

五、肺组织病理学改变

六、实时荧光定量PCR结果(SYBR Green Ⅰ法)

七、肺泡巨噬细胞免疫细胞化学结果

分析与讨论

一、关于大鼠模型的制作

二、关于肺泡巨噬细胞和外周血PMN的分离、纯化和鉴定

三、GITR／GITRL信号与哮喘的关系

四、哮喘与中性粒细胞及肺泡巨噬细胞的关系

五、关于糖皮质激素及哮喘治疗

结论

今后的研究方向

参考文献

附录

致谢

综述 GITR／GITRL信号通路的研究进展

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