肝细胞生长因子诱导慢性粒细胞白血病K562细胞抗凋亡效应及分子机制研究

摘要

目的：克隆肝细胞生长因子(HGF)基因，构建重组真核表达载体;观察HGF蛋白诱导经足叶乙甙(VP-16)处理后人慢性粒细胞白血病K562细胞(K562细胞)拮抗凋亡效应;HGF基因重组表达载体转染K562细胞，观察HGF基因的表达及基因转染对K562细胞凋亡发生的抑制作用，阐述HGF诱导K562细胞抗凋亡效应的分子机制。
　　 方法：
　　 1.HGF基因的克隆与重组克隆载体的构建及鉴定提取人肝组织总RNA，采用RT-PCR，获得HGF基因cDNA，与载体pMD19-TSimple连接，构建pMD19-T simple-HGF重组克隆载体。转化重组克隆载体pMD19-TSimple-HGF的大肠杆菌E.Coli DH5α，经氨苄青霉素筛选获得阳性菌株，增菌后采用菌落直接PCR、测序等方法鉴定HGF基因重组克隆载体。
　　 2.HGF基因重组真核表达载体的构建及鉴定HGF基因重组克隆载体pMD19-T Simple-HGF行MluⅠ、SalⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，与载体pVITRO2-mcs连接构建重组表达载体pVITRO2-mcs-HGF。以冷CaCl2法转化E.Coli DH5α，经潮霉素B进行筛选，采用PCR、酶切等方法进行鉴定。
　　 3.潮霉素B筛选浓度的确定取转染后处对数生长期K562细胞，分别加入不同浓度的潮霉素B，于37℃，5％CO2静置培养，以培养10～14天后无K562细胞存活的最小浓度为潮霉素B筛选浓度。
　　 4.HGF基因的转染与阳性克隆鉴定脂质体转染法将重组表达载体pVITRO2-mcs-HGF转染K562细胞，37℃、5％CO2静置培养24 h后，加入潮霉素B进行筛选。以未处理K562细胞、加脂质体K562细胞为空白对照，以转染载体pVITRO2-mcs质粒K562细胞为阴性对照。筛选后取存活细胞稀释后行单个细胞培养形成克隆并扩大。取扩大后K562细胞，提取总RNA，行RT-PCR法检测HGF基因的存在。
　　 5.HGF基因转染后重组蛋白表达的检测采用Western blot检测HGF基因转染后K562细胞提取物中重组蛋白。以未转染组、载体pVI TRO2-mcs转染组作为对照。
　　 采用ELISA法定量测定第1、9、16代培养物上清中重组蛋白浓度。
　　 6.HGF基因转染后mRNA表达水平的检测分别提取第1、9、16代的重组载体pVITRO2-mcs-HGF转染的K562细胞总RNA，RT后采用实时FQ-PCR检测HGF基因mRNA的表达水平，评价其表达的稳定性，以未转染组、载体pVITRO2-mcs转染组为对照组。
　　 7.CCK-8细胞毒性试验确定VP-16的凋亡诱导浓度经37℃，5％ CO2培养12h，加入不同浓度的VP-16(0.1～400μg/ml)，继续培养24 h后加入CCK-8工作液，孵育3～5 h，经酶标仪测定吸光度，以达到50％抑制率的最小浓度为VP-16工作浓度。
　　 8.透射电镜检测凋亡细胞形态K562细胞置37℃、5％ CO2静置培养12h后，加入VP-16处理24 h，离心收集，用戊二醛和锇酸行双固定，依序经乙醇、纯丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，电镜下观察。以未经VP-16诱导细胞为对照组。
　　 9.HGF抗K562细胞凋亡的体外实验K562细胞接种后加入HGF蛋白（终浓度为100 ng/ml），或HGF基因转染的K562细胞，常规静置培养24 h，VP-16（终浓度1μg/ml）处理24 h后，再按相关实验设计（设对照组、实验组等）进行操作。
　　 10.苏木素-伊红(HE)染色检测HGF对细胞凋亡的影响取细胞制涂片，乙醇固定，分别经核染液色液、分色液Ⅰ、分色液Ⅱ、浆染液染色处理，用增色液洗去多余的染液，吸干封片镜检，镜下计数。
　　 11.吖啶橙(AO)染色检测HGF对K562细胞凋亡的影响收集细胞，调节细胞浓度，加吖啶橙染淮室温避光染色15 min，加甘油，盖玻片封片，激光共聚焦显微镜下观察并计数。
　　 12.流式细胞术(FCM)检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻与核膜完整性观察HGF对细胞早期凋亡的影响收集经相关处理后细胞，制备单个细胞悬液，行Annexin V-FI TC/PI双染，1h内行FCM检测。
　　 13.FCM检测线粒体膜电位改变观察HGF对细胞早期凋亡的影响收集细胞，行JC-1染色，孵育，洗涤，重悬，上机检测。
　　 14.凋亡相关基因mRNA的检测同上经相关处理后，TrizoI法提取各组细胞总RNA，逆转录后行PCR，采用SYBRGreen荧光染料法半定量检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9等凋亡相关基因mRNA的表达。
　　 结果：
　　 1.HGF基因的克隆与重组克隆载体的构建与鉴定肝组织总RNA提取物行RT-PCR，凝胶电泳可见一特异性条带，与目的片段一致(2229 bp)，提示成功克隆HGF cDNA。将HGF cDNA与pMD19-T Simple-连接，并转化E.Coli DH5α，筛选出阳性菌落。将阳性菌落直接PCR产物、重组克隆载体SalⅠ、MluⅠ双酶切产物及未酶切重组载体进行琼脂糖凝胶电泳，发现特异性条带存在。同时，取纯化重组克隆载体pMD19-T Simple-HGF行测序，结果与Genebank报道的序列相同，提示HGF基因重组克隆载体pMD19-T Simple-HGF成功构建。
　　 2.HGF基因重组真核表达载体的构建与鉴定HGF基因重组克隆载体pMD19-T Simple-HGF行双酶切后取目的片段与pVITRO2-mcs连接，采用潮霉素B筛选pVITRO2-mcs-HGF转化E.Coli DH5α后的阳性菌落。将HGF基因的RT-PCR产物、阳性菌落直接PCR产物、重组表达载体Sal和MluⅠ双酶切产物、重组表达载体提取物等同时电泳，发现存在与目的片段大小一致的特异性条带(2229 bp)，提示HGF基因重组真核表达载体pVITRO2-mcs-HGF构建成功。
　　 3.筛选用潮霉素B浓度的确定经不同浓度潮霉素B处理10～14天后，观察K562细胞存活情况，确定75μg/ml作为实验用潮霉素B筛选浓度。
　　 4.HGF基因转染后阳性K562细胞的筛选及鉴定经75μg/ml潮霉素B处理1w，各组均出现大面积细胞死亡，至14d时空白组、阴性组均死亡，而实验组仍存活。存活细胞经潮霉素B作用下行单个细胞克隆扩大培养。提取扩大培养后细胞总RNA行RT-PCR,电泳扩增产物发现实验组细胞存在特异性的条带(2229 bp)，提示HGF基因重组表达载体pVITRO2-mcs-HGF成功转染K562细胞。
　　 5.HGF基因转染后重组蛋白表达的检测经Western blot发现HGF基因转染后的K562细胞裂解液存在大小约85 kDa蛋白条带，而未转染组和载体pVITRO2-mcs转染组均为阴性，提示HGF基因转染后K562细胞后可表达重组蛋白。
　　 ELISA定量检测第1、9、16代培养物中重组蛋白，结果发现:第1、9、16代重组蛋白分别4.52±0.35 ng/ml、4.47±0.54 ng/ml、4.37±0.28 ng/ml，代间差异无统计学意义(P＞0.05)，提示HGF基因转染后可在K562细胞稳定表达。
　　 上述结果证实HGF基因转染K562细胞后稳定表达。
　　 6.HGF基因转染后HGF mRNA表达的检测采用实时FQ-PCR检测第1、9、16代培养物HGF mRNA的水平，结果发现:第1、9、16代HGF基因转染组的HGF mRNA分别为7.89±0.38、6.79±0.52、6.62±0.48，代间差异无统计学意义(P＞0.05)，而对照组呈无或极弱表达，提示HGF基因转染后可在K562细胞稳定表达。
　　 7.CCK-8法检测VP-16对细胞增殖的影响CCK-8检测不同浓度VP-16对K562细胞增殖影响的结果显示，抑制效果随着VP-16浓度增加而明显增强，24 h内达到半数抑制率（48.4±5.6）％的最低浓度为1μg/ml，确定将1μg/ml作为后续实验的VP-16诱导浓度。
　　 8.透射电镜观察经VP-16诱导后细胞形态的变化经VP-16处理后在透射电镜下发现:对照组细胞形态正常，而实验组细胞可见典型凋亡细胞的形态改变，提示VP-16可以有效诱导细胞凋亡。
　　 9.HE染色检测HGF对细胞凋亡的影响HE染色结果发现，VP-16处理的细胞凋亡率显著增加，明显高于未处理组（P＜0.001，P＜0.05），但HGF蛋白组凋亡率明显低于VP-16处理组(P＜0.05);未转染组、载体pVITRO2-mcs转染组和HGF基因转染组的细胞经VP-16处理后，凋亡率明显增加(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)，提示VP-16可有效诱导细胞凋亡，但HGF基因转染组的凋亡率明显低于其他组(P＜0.001，P＜0.001)，提示HGF可抑制凋亡发生。
　　 10.AO染色检测HGF对K562细胞凋亡的影响AO染色结果发现，经VP-16处理组的凋亡率显著高于未处理组(P＜0.001)，而HGF蛋白组的凋亡率明显低于VP-16处理组（P＜0.05）;经VP-16处理后，HGF基因转染组的凋亡率显著低于未转染组和载体pVITRO2-mcs转染组(P＜0.05，P＜0.05)，提示表明HGF可抑制VP-16所诱导的细胞凋亡。
　　 11.FCM检测PS外翻与核膜完整性观察HGF对K562细胞早期凋亡的影响FCM检测发现，经VP-16处理后，各组早期凋亡的细胞率显著增加(P＜0.001，P＜0.001)，但HGF蛋白组的凋亡率明显较低(P＜0.05);经VP-16处理后，载体pVITRO2-mcs转染组、未转染组和HGF基因转染组的凋亡率显著增高(P＜0.05)，但HGF基因转染组的凋亡率明显低于其他组（P＜0.05，P＜0.05），证实HGF具拮抗早期凋亡发生的作用。
　　 12.FCM检测线粒体膜电位改变观察HGF对K562细胞早期凋亡的影响线粒体膜电位变化检测结果发现，经VP-16处理后，线粒体膜电位的化显著增加（P＜0.001），但HGF蛋白组明显较低（P＜0.001）;经VP-16处理后，载体pVITRO2-mcs转染组、未转染组和HGF基因转染组的线粒体膜电位的变化率显著增高(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)，而HGF基因转染组的变化明显低于其他组(P＜0.001，P＜0.001)，提示HGF具抑制早期凋亡发生的作用。
　　 13.凋亡相关基因mRNA的检测结果发现，VP-16处理后各组Bcl-2 mRNA表达量均明显低于未处理组(P＜0.001)，但HGF蛋白组的Bcl-2mRNA表达量明显高于VP-16处理组(P＜0.001);VP-16处理后各组Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA表达量均明显高于未处理组(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)，而HGF蛋白组Bax mRNA、Caspase-3mRNA、Caspase-9 mRNA表达量明显低于VP-16处理组(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001)。对HGF基因转染的的各组细胞检测结果发现Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9等mRNA表达存在相似变化(P＜0.001)。
　　 上述结果证实HGF具拮抗凋亡的生物学作用。
　　 结论：成功克隆HGF基因，构建了其重组真核表达载体pVITRO2-mcs-HGF。HGF基因成功转染K562细胞并稳定表达。研究证实，HGF蛋白和基因转染均可明显抑制K562细胞凋亡的发生，提示HGF具有拮抗凋亡的生物学效应，其抗凋亡作用经调控PI3K/AKT途径而实现。

目录

摘要

前言

参考文献

实验方案和技术路线

第一部分 肝细胞生长因子基因重组真核表达载体的构建及在K562细胞的转染

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

参考文献

第二部分 肝细胞生长因子诱导K562细胞抗凋亡的生物学效应

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

参考文献

全文小结

符号说明

综述 肝细胞生长因子的研究现状及展望

附录

致谢

声明