苯暴露对小鼠凋亡基因表达与甲基化及精子活力的影响

摘要

苯被广泛应用于工业生产和日常生活，暴露极为普遍。长期以来职业性苯中毒事件屡有发生，近年来儿童白血病也在不断增加。因此，预防和控制苯的危害具有重要的公共卫生学意义。
　　 苯的毒性效应与细胞凋亡（apoptosis）密切相关，异常凋亡是苯中毒表现的一个主要细胞学机制。如苯代谢产物引起血液先祖细胞的过度凋亡，导致造血功能抑制，表现为再生障碍性贫血。而苯诱导的突变细胞如果逃避了凋亡，则可能发展为多种血液系统的肿瘤。凋亡是多基因参与的复杂过程，目前苯介导的骨髓细胞凋亡的详细分子机制还不清楚，是否涉及凋亡相关基因的甲基化变异，尚未见报道。此外，以往对苯毒性的相关研究主要集中在血液系统，对雄（男）性生殖系统的损害作用重视不足，尽管已有少数高浓度苯暴露引起精子活力下降的毒理学报道，但低浓度苯暴露能否对精子活力产生影响还不清楚。
　　 本研究以C57/BL6J雄性小鼠为受试对象，模拟职业人群的暴露方式，实施8h/天、5天/周、共13周的亚慢性苯动式吸入毒性实验。研究内容包括3部分:
　　 1.亚慢性苯吸入染毒小鼠骨髓细胞周期和凋亡检测方法:
　　 6-7周龄C57/BL6J雄性小鼠随机分成对照组、1ppm组、100ppm组3组，每组40只，采用动式染毒柜实施亚慢性吸入染毒。
　　 处死小鼠，收集骨髓细胞，PI染色结合流式细胞仪检测骨髓细胞周期分布及凋亡状况。
　　 结果:
　　 各组G0+G1期细胞比例为:100 ppm组＞对照组＞1 ppm组(P＜0.01);1 ppm组表现明显的S期细胞增多;100 ppm组G2/M期细胞急剧减少;苯暴露组细胞凋亡水平(Debris)明显大于对照组(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 苯暴露诱导了细胞凋亡并改变了细胞周期分布，ROS可能与苯介导细胞周期变化有关。
　　 2.小鼠骨髓凋亡相关基因Survivin、Bcl2(l)13、Aif的表达和甲基化检测方法:
　　 实时荧光定量PCR检测8个小鼠凋亡相关基因在骨髓细胞中的表达，通过初步结果筛选出有苯剂量效应的基因Survivin、Bcl2(l)13、Aif并加大样本验证。同时应用Sequenom MassARRAY(@)Methylation定量测定其启动子区CpG岛甲基化水平。
　　 结果:
　　 实时荧光定量PCR结果显示，在骨髓细胞中，苯暴露组相比对照组，Survivin、Bcl2113、Aif mRNA表达水平降低，100 ppm组中三个基因均呈显著降低(P＜0.05)，而且在1 ppm组中Survivin也明显降低(P＜0.05)。
　　 甲基化水平检测结果显示，总体上，基因Survivin启动子区CpG岛平均甲基化水平在三组中都较低且无明显组间差异(0 ppm组:2.9％±0.2％;1 ppm组:2.8％±0.6％;100 ppm组:3.1％±0.4％，n=10)，其它两基因中也无明显改变，基因Bcl2(l)13(0 ppm组:4.2％±0.5％;1 ppm组:4.1％±0.1％;100ppm组:4.0％±0.5％，n=10)，基因Aif(0 ppm组:3.5％±0.5％;1ppm组:3.5％±0.5％;100 ppm组:3.5％±0.4％，n=10)。苯暴露组中，三个基因均有两个CpG位点与对照组有统计学差异，所有这些位点甲基化水平都低于5％。
　　 结论:
　　 亚慢性苯暴露导致小鼠骨髓细胞凋亡相关基因(Survivin、Bcl2(l)13、Aif)mRNA表达下降涉及凋亡与周期依赖性，然而与其启动子区CpG岛甲基化水平关联较少。
　　 3.小鼠精子活力检测方法:
　　 处死小鼠，收集附睾精子，采用IVOS精子动力分析仪测定精子活力。
　　 结果:
　　 比较对照组，高剂量组小鼠体重和睾丸重量显著下降(P＜0.05)，睾丸脏器系数未见明显改变;低剂量组未显示体重、睾丸重量和睾丸脏器系数方面的有意义变化(P＞0.05)。
　　 与对照组比较，低剂量组小鼠精子直线运动速度(VSL)、前向性(STR)、直线性(LIN)和鞭打频率(BCF)均有统计学意义的降低(P＜0.05);高剂量组精子密度、活动率、平均路径速度（VAP）、曲线运动速度(VCL)、VSL、LIN及STR均显著下降(P＜0.05);且高剂量组精子活动率与低剂量组比较也显示有统计学意义的降低(P＜0.05);精子头长比(Elongation)和侧摆幅度(ALH)在各组中均未见统计学差异。
　　 结论:
　　 说明即使是低浓度苯暴露(1 ppm)也能导致小鼠精子活力下降。

目录

摘要

前言

第一部分 苯暴露对小鼠凋亡相关基因表达与甲基化状态的影响

一、材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

二、结果

1．苯浓度测定

2．细胞周期及细胞凋亡检测

3．骨髓细胞Survivin、Bcl2l13、Aif mRNA表达

4．Survivin、Bcl2l13、Air基因启动子区的甲基化状态

三、讨论

第二部 分苯暴露对小鼠精子活力的影响

一、材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

二、结果

1．动物的一般状况

2．精子活力测定

三、讨论

参考文献

附录

致谢

综述 细胞凋亡与癌症

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