肺炎链球菌血清型和毒力基因的核酸扩增检测及对炎症小体激活的研究

摘要

目的:
　　 1.针对肺炎链球菌的荚膜基因，设计引物序列，建立起准确、快速的血清分型新方法。
　　 2.了解肺炎链球菌各毒力基因的携带情况。
　　 3.研究肺炎链球菌（侵袭性与非侵袭性）刺激巨噬细胞后对炎症小体激活的影响状况。
　　 方法:
　　 1.收集温州医学院附属第二医院2012年1月至8月的痰液、脓液、血液、脑脊液、胸水等临床标本，通过Optochin敏感试验，胆汁溶菌试验，经VITEK2 COMPACT型全自动细菌分析仪对收集的标本进行再验证。
　　 2.采用连续多重PCR技术，分7个反应，对肺炎链球菌的荚膜进行血清分型。
　　 3.采用PCR方法对前4位的肺炎链球菌荚膜血清型(19F，6A/B，19A，23F)DNA进行三个毒力基因(psaA、ply、lytA)的检测。
　　 4.培养THP-1细胞，经100ng/ml浓度的PMA刺激转化为巨噬细胞，计数至5.0×105/ml，吸取1.0ml巨噬细胞加入到4个12孔细胞培养板中，再向其中加入100μl浓度为1.0McFarland的肺炎链球菌（侵袭性与非侵袭性）作为实验组，100μl生理盐水作为对照组，均置37℃5％～7％CO2孵箱中分别孵育0h、2h、4h和8h，吸出细胞悬液至EP管，4000rpm离心10min取上清液，用ELISA法检测上清液中Caspase-1、IL-1β和IL-18的浓度。
　　 结果:
　　 1.收集的98株菌株均为肺炎链球菌，其中侵袭性肺炎链球菌共6株，4株来自脑脊液，1株来自血液，1株来自胸水，其余的92株均为非侵袭性肺炎链球菌，都来自痰液。
　　 2.共检出9种血清型，分别是19F，6A/B，19A，23F，15B，3F，14，1，15A，共85株，检出率86.7％(85/98)，前3个反应检出率为79.6％(78/98)，其中19F型检出率38.8％(38/98)，6A/B型检出率18.4％(18/98)，19A型检出率11.2％(11/98)，23F型检出率8.2％(8/98)，15B型检出率4.1％(4/98)，3F型检出率3.0％(3/98)，14型检出率1.0％(1/98)，1型检出率1.0％(1/98)，15A型检出率1.0％(1/98)。
　　 3.前4种血清型(19F，6A/B，19A，23F)肺炎链球菌均100％携带psaA、ply、lytA毒力基鼠。
　　 4.经PMA诱导的THP-1细胞由悬浮生长变为贴壁生长。
　　 5.Caspase-1、IL-1β、IL-18的浓度均随时间的增加而呈现增高趋势，侵袭性肺炎链球菌组、非侵袭性肺炎链球菌组与生理盐水组在同一个时间点比较，侵袭组和非侵袭组的Caspase-1、IL-1β、IL-18的浓度均高于生理盐水组的浓度(P＜0.05)，侵袭性组Caspase-1的浓度高于非侵袭性组的浓度(P＜0.05)，而IL-1β、IL-18的浓度在这两组间没有差异性(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 1.本院肺炎链球菌血清型以19F，6A/B，19A，23F四型为主，19F型最多，连续多重PCR前3个反应就能确定大部分菌株的血清型。
　　 2.肺炎链球菌中普遍存在psaA、ply、lytA三个毒力基因。
　　 3.经PMA诱导，THP-1细胞由悬浮生长变为贴壁生长的巨噬细胞。
　　 4.肺炎链球菌刺激巨噬细胞，能激活炎症小体，调节caspase-1活性，使细胞上清液中Caspase-1、IL-1β和IL-18的浓度增加。

目录

缩略词表

摘要

前言

第一部分 连续多重PCR对肺炎链球菌荚膜血清型分型的研究

材料和方法

结果

分析与讨论

第二部分 不同血清型肺炎链球菌毒力基因的携带状况

材料和方法

结果

分析与讨论

第三部分 肺炎链球菌刺激巨噬细胞炎症小体的激活研究

材料与方法

结果

分析与讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述 肺炎链球菌的传统血清型分型方法及毒力因子概况

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