应用免疫学方法及PCR技术检测华支睾吸虫的研究

摘要

目的：⑴建立敏感、特异的双抗夹心ELISA法，检测华支睾吸虫病人粪样中的排泄分泌抗原(excreted-secretory antigen，ES antigen)，用于测定人群中华支睾吸虫的感染；⑵建立高特异、高灵敏的PCR方法，检测鱼肉中的华支睾吸虫囊蚴DNA，应用于鱼类食品的卫生检疫及华支睾吸虫中间宿主的感染调查。
　　 方法：①对17株华支睾吸虫单克隆抗体应用间接ELISA法确定其亚类，并用位点阻断ELISA法，进行位点类别分类；②采用单抗和单抗或单抗和多抗之间的二二配对实验，以夹心ELISA法筛选最佳抗体组合；③比较常规双抗夹心ELISA法和生物素-链亲和素(Biotin-Streptavidin，BS)双抗夹心ELISA法检测ES抗原的敏感性，确定粪ES抗原的ELISA检测系统；④通过对两种粪ES抗原抽提方法BSA法和PBS法的对比实验研究，确定最佳粪ES抗原的抽提方法；⑤通过检测纯化的ES抗原、模拟粪ES抗原、华支睾吸虫病人粪样和其他消化道寄生虫病人粪样对建立的双抗夹心ELISA方法进行敏感性和特异性的初步评估；⑥对以引物CS1F/CS1R建立的PCR体系中的Mg2+浓度、引物浓度和退火温度进行优化，确定最佳的PCR反应条件；⑦通过检测华支睾吸虫囊蚴DNA和其他吸虫成虫的DNA对引物为CS1F/CS1R和OP2/Cs的二组PCR反应体系进行敏感性和特异性分析；⑧对比研究蛋白酶K简单消化法、煮沸法和消化-煮沸法等三种DNA抽提方法，建立从感染华支睾吸虫囊蚴的鱼肉中抽提DNA的最佳方法；⑨通过检测31条华支睾吸虫阳性麦穗鱼和31条阴性鱼对建立的PCR检测方法进行初步评估。
　　 结果：⑴17株华支睾吸虫单抗分成两类单抗亚类，其中Cs30和Cs32两株单抗属于IgM，其余15株为IgG1；单抗识别抗原位点也分成两类，其中Cs30、Cs13、Cs17、Cs51和Cs32五株单抗识别同一抗原表位，其余12株单抗(包括Cs63)则识别另一相同的抗原表位；⑵对17株单抗中效价最高的Cs32和Cs63进行特异性评估，两株单抗均不与血吸虫成虫粗抗原、血吸虫虫卵抗原以及卫氏并殖吸虫成虫粗抗原发生交叉反应，表现出对华支睾吸虫高度的特异性；⑶通过二二抗体配对试验筛选出最佳抗体夹心组合为单抗+多抗；⑷在同样的单抗包被(Cs32或Cs63)条件下，BS-ELISA检测系统比HRP-ELISA检测系统更敏感，可用于粪ES抗原检测；⑸确定BS-ELISA检测方法检测华支睾吸虫粪ES抗原，抽提粪ES方法为PBS法，包被抗体为Cs63；该系统可检测到23.4ng的粪ES抗原；⑹应用建立的生物素-链亲和素双抗夹心ELISA检测方法检测华支睾吸虫病人的敏感度为80.9％，其中对每克粪虫卵数(EPG)大于500的中高感染度的华支睾吸虫病人能够100％检出；检测蛔虫、血吸虫、鞭虫、钩虫等其他寄生虫病人的粪样以及正常人粪样，仅与蛔虫(13％)、鞭虫(10.5％)病人粪样有部分交叉反应，检测正常人粪样有9.4％的假阳性；⑺经优化，以CS1F/CS1R为引物的PCR体系最佳反应条件是：引物浓度为0.67uM、Mg2+浓度为1.5-2.0 mM，退火温度为53.5℃；⑻特异性引物CS1F/CS1R可从华支睾吸虫囊蚴和成虫DNA中扩增出283bp的特异性片段，另一特异性引物OP2/Cs则扩增出301bp的特异性片段；两对引物对宫川棘口吸虫、抱茎棘隙吸虫、东方次睾吸虫、日本血吸虫、卫氏并殖吸虫等基因组DNA均未扩增出任何条带；结果表明，两对引物具有对华支睾吸虫高度的特异性；⑼引物为CS1F/CS1R的PCR检测体系最低能检测到0.67个C.s囊蚴，引物为OP2/Cs时则能检测出4×10-5个C.s囊蚴，敏感性优于CS1F/CS1R的PCR检测体系，可用于鱼肉中的华支睾吸虫囊蚴DNA的检测；⑽确定以消化-煮沸法从感染华支睾吸虫囊蚴的鱼肉中抽提囊蚴DNA，DNA提取液最佳用量为10-15μl；⑾应用经优化的PCR检测方法检测31个华支睾吸虫阳性鱼样品均扩增出301bp的特异性条带，阳性检出率为100％；31个阴性样品，均未扩增出特异性条带，假阳性率为0。
　　 结论：①本研究建立的生物素-链亲和素双抗夹心ELISA检测方法检测粪ES抗原具有较高的敏感性和特异性，对测定人群中华支睾吸虫的感染具有一定的应用前景；②引物CS1F/CS1R和OP2/Cs对华支睾吸虫DNA都具有高度的特异性，并且引物OP2/Cs具有更高的敏感性，能检测到4×10-5个C.s囊蚴；③建立了从感染华支睾吸虫囊蚴的鱼肉中抽提囊蚴DNA的方法(消化-煮沸法)，并用于引物为OP2/Cs的PCR检测方法，检出率100％，假阳性率0，有望应用于鱼类食品的卫生检疫及华支睾吸虫中间宿主的感染调查。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文全称及缩写对照

前 言

第一部分 检测华支睾吸虫病人粪样中ES抗原的双抗夹心ELISA方法的建立

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 检测鱼肉中华支睾吸虫囊蚴的PCR方法的建立

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

致 谢

附 录：表1五种鱼源性吸虫与华支睾吸虫的比较

综述：PCR检测食源性吸虫的研究进展