Il-11对ITP患者T细胞亚群及T-bet和GATA-3影响的研究

摘要

特发性血小板减少性紫癜(ITP)又称免疫性血小板减少性紫癜，是一种临床最常见的原因尚不明确的获得性出血性疾病，年发病率为5-20/10万，约占临床出血性疾病的30％。临床表现为皮肤、粘膜出血，严重者有内脏出血;实验室检查可见血小板计数减少，骨髓中巨核细胞成熟障碍，抗血小板自身抗体的出现等特征。ITP的发病机制错综复杂，以往研究着重探讨体液免疫功能紊乱与ITP发病的关系，而近年来研究表明细胞免疫功能紊乱与ITP的发病有关。根据细胞因子的分泌模式，CD4+的Th细胞主要分为Th1和Th2类细胞。Th1类细胞因子主要包括IFN-γ，IL-2、IL-12、IL-15、TNFα，Th2类细胞因子主要为IL-4、IL-10、IL-13等，一般常以IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2的比例。T-bet和GATA-3是调节Th1和Th2类细胞因子表达的两个重要的转录因子。T-bet是转录因子T-box家族的成员之一，主要是在免疫系统中表达。T-bet的表达在Th1细胞发展早期阶段迅速的增高，但是在Th2细胞发展的过程中不表达，进一步的研究中发现T-bet可诱导Th1分化和抑制Th2分化。GATA-3是锌指蛋白GATA家族成员之一，它在促进Th2表型的形成和抑制Th1表型的形成中起核心作用。T-bet和GATA-3的mRNA分别在产生Th1样和Th2样细胞因子的多种细胞中的表达上调，提示T-bet/GATA-3可以在许多种情况下反映Th1/Th2细胞因子的平衡。T-bet/GATA-3可以比较容易地从混合细胞群中提取总RNA，因此我们可以采用RT-PCR技术通过检测T-bet和GATA-3的mRNA含量的方法来反应Th1/Th2细胞因子的平衡，相对于单一的转录因子测量而言，T-bet和GATA-3的相对表达更能反映Th1/Th2细胞因子的平衡，尤其是采用新鲜血液作为标本，更能真实的反映Th1/Th2细胞因子的体内状况。GATA-3的基因表达在Th1和Th2状态下均比T-bet的表达敏感。T-bet/GATA-3在混合细胞群中mRNA水平可以反映Th1/Th2细胞因子的基因和蛋白质水平。细胞因子IL-11由人类骨髓基质细胞（成纤维细胞）及间质细胞分泌产生，具有多种生物活性。在免疫调节，造血调控，尤其是巨核细胞、血小板生成方面具有重要作用。目前的研究认为IL-11能促进Th1向Th2分化。近年来，国内外陆续有报道将IL-11应用于慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)的治疗，并取得较好的疗效，但对其在ITP治疗中的作用机制一直无人进行研究。
　　 目的:
　　 研究ITP患者和正常组外周血单个核细胞(PBMNC)中Th1、Th2细胞比例及 T-bet mRNA、GATA-3mRNA含量;在ITP患者PBMNC中加入不同浓度IL-11，体外培养后，测定Th1、Th2细胞比例及T-bet mRNA、GATA-3mRNA含量，探讨IL-11对ITP患者CD4+T细胞Th1、Th2细胞比例及T-bet mRNA、GATA-3mRNA的影响。
　　 研究方法:
　　 一:采用流式细胞仪检测正常组与ITP组Th1、Th2细胞占外周血淋巴细胞比值及Th1/Th2比值大小;应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-time fluorescence quantitative，RT-PCR)技术检测正常组与ITP组转录因子mRNA T-bet、mRNA GATA-3表达量及T-bet/GATA-3。
　　 二:从30例ITP患者中随机抽取10例患者抽取外周血提取PBMNC加入不同浓度IL-11(0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)培养4日后应用流式细胞仪和RT-PCR分别测量Th1、Th2细胞占外周血淋巴细胞比值、Th1/Th2比值大小及T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表达量、T-bet mRNA/GATA-3 mRNA。
　　 结果:
　　 1、与正常组相比，ITP组Th1细胞比例明显高于正常组、Th2明显低于正常组，Th1/Th2比值明显高于正常组，P均小于0.05，差异有显著意义;ITP组较正常组PBMNC的T-bet mRNA水平升高，GATA-3 mRNA降低，T-bet/GATA-3比值高于正常组，均P＜0.05，差异有显著意义。
　　 2、将ITP患者PBMNC加入浓度分别为0ng/ml、25ng/m1、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的IL-11培养体系中培养:各浓度组间Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2比值分别进行单因素方差分析（方差齐性检验P＞0.1），分别计算F值与P值，均P＜0.05，说明不同浓度IL-11对Th1、Th2及Th1/Th2影响作用有显著意义。当IL-11浓度为100ng/ml时，Th1、Th2及Th1/Th2比值与对照浓度为0ng/ml组的差异最大，表现为Th1及Th1/Th2比值下降，Th2水平升高，差异有显著意义。各浓度组间T-betmRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3分别进行单因素方差分析（方差齐性检验P＞0.1），分别计算F值与P值，P均小于0.05，说明不同浓度IL-11对T-betmRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3影响作用具有显著意义，IL-11浓度为100ng/ml时，与浓度为0ng/ml组相比，T-bet mRNA、GATA-3及T-bet/GATA-3比值差异最为显著，T-bet mRNA水平及T-bet/GATA-3比值降低，GATA-3 mRNA升高，差异有显著意义。
　　 结论:
　　 ITP患者存在Th1极化优势;IL-11在体外能促使ITP患者从Th1极化优势向Th2极化优势转变。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验对象

3 统计学分析

4 实验方法

实验结果

5．2：流式细胞仪测定CD4+T细胞Th1、Th2结果

5．3：RT-PCR测定T-bet mRNA、GATA-3mRNA及T-bet／GATA-3比值

讨论

结论

参考文献

综述 细胞免疫对特发性血小板减少性紫癜免疫机制的影响

致谢

声明