ATRQβ-001疫苗改善糖尿病肾损伤及作用机制研究

摘要

第一部分ATRQβ-001疫苗对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠有效性研究
　　目的：前期工作中我们研制出一种针对人血管紧张素Ⅱ受体1型的短肽治疗性疫苗ATRQβ-001，本研究旨在验证 ATRQβ-001疫苗在糖尿病肾病模型老鼠上是否有效，以链脲佐菌素（STZ）腹腔注射方法建立糖尿病肾病模型。
　　方法：将ATR-001短肽与Qβ-2aa病毒样颗粒（VLP）用化学耦联剂Sulfo-SMCC耦联制备ATRQβ-001疫苗。Sprague Dawley大鼠随机分为对照组和糖尿病组，糖尿病组用链脲佐菌素（60mg/kg）腹腔注射,1周后，模型组又随机分为4组，每组15只老鼠：（1）糖尿病肾病（DN）组：等剂量皮下注射生理盐水干预；（2）奥美沙坦（OM）组：按5mg/kg/d给予灌胃；（3）ATRQβ-001组：将ATRQβ-001疫苗与氢氧化铝佐剂乳化后，按400?g/只于第0、14、21天皮下多点免疫；（4）Qβ VLP（VLP）组：将QβVLP与氢氧化铝佐剂乳化，按400?g/只于第0、14、21天皮下多点免疫。干预后继续观察14周。所有大鼠每周称量体重，监测血糖，每两周测定ATR-001特异性抗体滴度，每四周测定血压，于第4、8、14周代谢笼测定老鼠尿量及24小时尿蛋白量。饲养结束后，检测血肌酐、尿素氮水平和肾脏病理结构改变。
　　结果：ATRQβ-001疫苗可产生较高滴度抗 ATR-001抗体，并可有效降低糖尿病老鼠的血压水平，最高降幅达19.4mmHg。疫苗免疫后不影响血糖血脂水平，但可降低24小时尿蛋白量、血肌酐、尿素氮水平，并减轻肾体比，逆转nephrin、podocin表达下降，减轻足细胞损伤和系膜扩张，且与奥美沙坦治疗组无明显统计学差异。
　　结论：ATRQβ-001疫苗可有效改善链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病模型大鼠的肾功能和血压水平，并减轻肾脏病理损害，与奥美沙坦治疗组无明显差异。
　　第二部分ATRQβ-001疫苗肾脏保护机制研究
　　目的：本研究旨在探讨ATRQβ-001疫苗的作用机制，主要从炎症纤维化和对RAS系统的调控两方面研究，并在体外用抗ATR-001抗体在大鼠肾脏系膜细胞系上进一步评价。
　　方法：检测血浆中肾素活性（PRA）、血管紧张素（Ang）Ⅱ、Ang（1-7）、肾脏皮质AngⅡ和Ang（1-7）含量，其中PRA和AngⅡ用放射免疫分析方法检测，Ang（1-7）用高压液相色谱技术检测。Masson三色染色观察肾脏纤维化，免疫组化检测肾脏TGF-β1表达和单核巨噬细胞浸润情况，蛋白免疫印迹（western blot）检测RAS相关蛋白表达和ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平，实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测RAS成分、促炎细胞因子和促纤维化生长因子mRNA表达水平。体外实验评估抗ATR-001抗体（Anti-ATR-001）对高糖诱导的大鼠肾脏系膜细胞影响，western blot检测TGF-β1和磷酸化ERK、Smad3水平，qRT-PCR检测TGF-β1、胶原蛋白（Collagen）Ⅳ和纤连蛋白（Fibronectin）表达。
　　结果：与奥美沙坦相比，ATRQβ-001疫苗并不增加循环中PRA和AngⅡ浓度，二者均可降低肾脏组织中下调肾脏 AngⅡ浓度，并增加 Ang（1-7）含量，抑制肾脏局部ACE-AngⅡ-AT1R轴表达，上调ACE2-Ang（1-7）-mas轴。ATRQβ-001疫苗可有效减轻肾脏间质纤维化水平，并减少肾小球和间质巨噬细胞浸润数目，TGF-β1的表达和活性氧产生亦明显减少。肾脏组织炎性细胞因子和促纤维生长因子 mRNA表达也在经 ATRQβ-001疫苗和奥美沙坦治疗后有所下降，且与两组之间无统计学差异。体外实验中 Anti-ATR-001可有效抑制高糖刺激下肾脏系膜细胞（RMCs）TGF-β1表达和Smad3磷酸化水平，其下游CollagenⅣ和Fibronectin的表达亦下调
　　结论：ATRQβ-001疫苗主要通过调控RAS双轴和抑制炎症纤维化两方面起到肾脏保护作用。
　　第三部分ATRQβ-001疫苗的安全性研究
　　目的：ATRQβ-001疫苗可减轻STZ诱导的糖尿病肾病模型大鼠肾脏病理损害，将进一步在Sprague Dawley（SD）大鼠上观察疫苗的安全性。
　　方法：将ATR-001短肽与Qβ-2aa病毒样颗粒（VLP）用化学耦联剂Sulfo-SMCC耦联制备ATRQβ-001疫苗。Sprague Dawley大鼠随机分为对照组和ATRQβ-001疫苗组，每组10只老鼠，疫苗组按400?g/只于第0、14、21天皮下多点免疫，对照组给予等剂量皮下注射生理盐水。每两周测定抗ATR-001特异性抗体滴度，每四周测定血压。在长达150天的观察期后，ELISA方法检测血清中C3a和C5a含量，并取心脏、肺组织、肾脏、肝脏、脾脏，进行HE染色和CD14、CD19免疫组化染色，观察各组织脏器有无明显炎症反应及炎性细胞浸润情况，取肾脏组织再进行 Masson三色、PAS染色和电镜检测，确定有无免疫介导的肾脏病理损害。
　　结果：ATRQβ-001疫苗可产生较高滴度抗 ATR-001抗体，对正常老鼠血压水平无影响。血清中C3a和C5a含量与对照组无明显差异。HE染色显示疫苗组各组织未见明显炎症反应，CD14、CD19免疫组化染色亦未见单核细胞和B细胞浸润，肾脏组织未见系膜扩张、间质纤维化等病变，电镜下足突无融合消失，肾小球系膜区无增生，基底膜无增厚，且未见明显免疫复合物沉积。
　　结论：ATRQβ-001疫苗不降低正常老鼠血压，未产生明显免疫介导的组织病理损害，安全性良好。

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参考文献

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第一部分ATRQβ-001疫苗对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠有效性研究

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材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分ATRQβ-001疫苗肾脏保护机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分ATRQβ-001疫苗的安全性研究

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材料与方法

结果

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参考文献

实验总结

综述: 糖尿病肾病治疗的新进展

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