去双前肢直立诱导大鼠腰椎间盘退变模型的建立及骨痹合剂干预机制研究

摘要

目的:建立一种去双前肢直立大鼠腰椎间盘退变模型，使之与人类腰椎间盘突出症发病机制相似，在成功的建立此模型的基础上，观察骨痹合剂干预去双前肢直立诱导大鼠腰椎间盘退变模型的机制。 方法:选用孕期15日龄的SD大鼠3只，分笼饲养，把出生第10天的20只幼鼠，随机分为2组，分别为正常对照组和直立模型组。造模方法:按盐酸氯氨酮0.1g/kg体重行肌肉注射麻醉，将幼鼠去双前肢剪毛和清洁后，用碘伏消毒幼鼠上肢皮肤，取前臂近端1/3处横向切开皮肤，剥离筋膜和肌肉，暴露三角肌下血管神经束，并用丝线结扎，在结扎处远端用咬骨钳咬断肱骨，再用剪刀剪断皮肤、肌肉、血管和神经，使上肢截断。将盐酸庆大霉素滴入切口后，再将肌肉、筋膜、皮肤逐层缝合，最后在切口处涂金霉素眼膏防止感染。手术后置于饲养笼内继续饲养。在6月龄时处死两组大鼠，取下两组的腰椎，标本通过固定、脱钙、脱水、包埋、切片、展片、烤片，行HE+阿尔新兰复染、甲苯胺蓝及藏红固绿染色和CollagenⅠ、CollagenⅩ、TNF-α免疫荧光检测。评价模型是否成功。在评价模型成功的基础上，选用孕期15日龄的SD大鼠12只，分笼饲养，把出生第10天的80只幼鼠，随机分为2组（6月龄组和9月龄组），每组40只，并全部去双前肢（造模及喂养方法同前）。在大鼠5月龄时，将其中6月龄组随机分成4组，每组10只，分别为空白对照组、生理盐水组、骨痹合剂组、阳性药物对照组，分别给药干预1个月，空白对照组不给药，生理盐水组按1ml/100g灌胃，骨痹合剂组按骨痹合剂1ml/100g灌胃，阳性药物对照组以氨糖美辛1ml/100g灌胃。每隔12小时各给药一次，连续4周。在大鼠6月龄时，分别处死4组大鼠，取下腰椎，标本通过固定、脱钙、脱水、包埋、切片、展片、烤片，行HE+阿尔新兰复染、甲苯胺蓝染色、藏红固绿染色和CollagenⅠ、CollagenⅩ、TNF-α免疫荧光检测。9月龄组在8月龄时随机分为4组（分组方法同6月龄组），给药方法与6月龄组相同，均连续给药4周。在大鼠9月龄时，分别处死4组大鼠，标本的观察和检测方法同前。 结果:正常对照组的椎间盘结构正常，髓核居中，纤维环包绕四周、排列层次清晰呈整齐完整的板层状结构，终板完整;钙化层与非钙化层两层之间有潮标分布;生长软骨呈柱状排列，紧贴椎体。直立模型组中椎间盘形态改变，髓核内开始出现裂隙、髓核皱缩，纤维环内层部分纤维扭曲、排列紊乱与髓核的界线模糊，椎体结构有部分破坏，腰椎间盘软骨细胞发生变性、坏死，软骨终板出现钙化、断裂等组织形态学改变，椎间盘压缩变低。免疫荧光检测显示:直立模型组CollagenⅠ、CollagenⅩ、TNF-α阳性细胞比例均较正常对照组高。进行药物干预后，骨痹合剂组的椎间盘较其它三组比较，纤维环排列扭曲结构尚完整，层次尚清晰。髓核皱缩程度轻，软骨终版钙化层、潮标向软骨表层椎进，有部分软骨细胞染色不均匀，终板钙化层与非钙化层两层之间有潮标分布。免疫荧光检测显示:骨痹合剂组CollagenⅠ、CollagenⅩ、TNF-α阳性细胞比例较其它三组低。 结论:成功建立了去双前肢直立诱导大鼠腰椎间盘退变模型，该模型制作简便，可重复性好，与人类腰椎间盘突出症的发病机制相似，可为进一步研究腰椎间盘突出症的发病机制以及为开发其有效治疗措施奠定基础。骨痹合剂可延缓去双前肢直立大鼠诱导腰椎间盘退变模型椎间盘退变过程，可能通过下调细胞外基质CollagenⅠ、CollagenⅩ、TNF-α表达，延缓腰椎间盘的退变进程。

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摘要

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引言

第一部分 去双前肢直立诱导大鼠腰椎间盘退变模型的建立

前言

1 材料和方法

1．1 实验动物与分组

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

1．4 动物模型建立方法

1．5 取材及标本制备

1．6 形态学检测

1．7 免疫荧光检测

1．8 统计方法

2 结果

2．1 动物情况

2．2 腰椎间盘形态学改变

2．3 免疫荧光改变

3 结论

4 讨论

4．1 直立行走与腰椎间盘退变模型的关系

4．2 直立行走与中医肾主骨相关理论

4．3 TNF-α与椎间盘退变的关系

4．4 CollagenⅠ与椎间盘退变的关系

4．5 CollagenⅩ与椎间盘退变过程的关系

第一部分 研究小结

第二部分 骨痹合剂对去双前肢直立诱导大鼠腰椎间盘退变模型的干预

前言

1 材料和方法

1．1 实验动物与分组

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

1．4 动物模型建立方法

1．5 给药方法

1．6 取材及标本制各

1．7 形态学检测

1．8 免疫荧光检测

1．9 统计方法

2 结果

2．1 动物一般情况

2．2 腰椎形态学改变

2．3 免疫荧光改变

3 结论

4 讨论

4．1 中医与腰椎间盘突出症

4．2 骨痹合剂对腰椎间盘突出症的作用

第二部分 研究小结

全文研究小结

参考文献

综述：中医药治疗腰椎间盘突出症的临床研究进展

附录 课题经费来源

致谢