Plant Virus Discovery Using Next-Generation Sequencing Techniques

摘要

植物病害对食品安全和食物供应能造成重大损失，因此受到人们的广泛关注。由于植物病毒的多样性和对宿主的广泛适应性，对植物病毒引起的植物疾病的预防和控制具有很高的挑战性。为了防止植物病毒病的爆发，通常采取的策略是阻止病毒的进一步传播或者防止病毒病的早期出现。要想实现这一目的，必须使用迅速、敏感、准确的诊断方法尽早鉴定引起植物病害的病毒和发现可能的新病毒。通常使用的鉴定方法有物理学方法、生物学方法、血清学方法和分子生物学方法，但这些方法依赖于已有的关于病原体的认知，对新病毒的鉴定通常无能为力。随着技术的进步，二代测序技术已经成为病毒诊断的最佳选择，这种方法快速、准确、敏感而且成本低，最重要的是，它能够在缺少先验知识的情况下鉴定病原体。
　　在病毒感染植物后，宿主的Dicer-like(DCL)酶会将双链RNA剪切成21-24个碱基的小干扰RNA(siRNAs)，这些小于扰RNA能够结合到Argonaute(AGO)蛋白上，指导RNA诱导沉默复合体(RISCs)靶向互补的病毒RNA，造成病毒RNA的转录后沉默和降解。因此，RNA沉默机制剪切产生的21-24个碱基的小RNA可以用来重构感染植物病毒的完整基因组序列。因此我们主要对感染病毒的植物中由RNA沉默抗病毒反应产生的病毒siRNA分析来鉴定已知病毒和发现新病毒。我们首先发展了一套生物信息学流程用来快速准确地分析染病植物中的病毒siRNA序列，以便在没有先验知识的情况下发现和鉴定致病病毒。然后我们对烟草、玉米和草莓的叶子样本分别进行小RNA测序，应用生物信息学分析和分子生物学等技术手段来发现和鉴定植物病毒。烟草病毒的筛选使用了从中国安徽省各地收集的104份烟草样本。我利用这些样本构建了9个不同的小RNA文库并使用自己发展的生物信息学流程进行分析。通过分子生物学实验验证，从调查区域的烟草样本中鉴定出了来自8个病毒物种的22个分离株，包括黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒、胡椒斑点病毒、芸薹黄化病毒、辣椒脉斑驳病毒和蚕豆萎蔫病毒2号。对22个病毒分离株的系统发育与重组分析表明，这些病毒与已知病毒的亲缘关系较远。在玉米中我们发现了一个整体病毒属（Totivirus）的新成员。根据该病毒的基因组排列、与其他整体病毒的系统发育关系、病毒外壳蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶与其他整体病毒的序列相似性均低于50％，该病毒被确定玉米相关的整体病毒安徽株(Maize-associated totivirus Anhui，MATV-Ah)。同样在草莓中我们也发现了一个马铃薯X病毒属的新病毒，它与草莓轻型黄边病毒(SMYEV)MY-18株的碱基序列相似性只有64％，蛋白序列相似性最高只有73％，低于马铃薯X病毒属的物种划分阈值80％。该新病毒被暂时命名为草莓轻型黄边相关病毒-DSH15(SMYEaV-DSH15)。
　　本学位论文是综合应用二代测序技术、生物信息学分析和分子生物学等技术手段来快速、准确地发现和鉴定植物病毒。本论文清楚表明结合二代测序技术和生物信息学分析可以有效地在短时间内鉴定样本中病毒感染，可以用于快速准确的病毒诊断;通过结合分子生物学手段，能对新病毒快速的获得全长序列，便于进一步的进化分析;可指导建立对新植物病毒病害的常规诊断方法，来监控和预防新植物病毒病的大规模爆发。