甘蓝型油菜编码WIP-锌指蛋白的TT1基因家族的克隆及在黄、黑籽之间的差异表达

摘要

本文克隆了甘蓝型油菜TTl基因家族(BnTTl)2个成员的全长cDNA及其基因组序列，进行了相关的生物信息学分析及表达检测，构建了反义植物表达载体。主要研究结论为： 1．首次克隆了甘蓝型油菜BnTTl基因家族2个成员的全长cDNA和基因组序列。 设计特异引物进行RACE反应，得到BnTTl基因家族成员的5'和3'cDNA末端，然后扩增出2条与AtTTl对应的全长cDNA序列和基因组序列，命名为BnTTl-1和BnlTl-2，基因组序列分别为1919bp和1798bp，均由1个内含子和2个外显子组成，内含子分别为873bp和785bp。 Southern杂交显示，甘蓝型油菜中可能存在3个以上的．BnlTl基因家族成员，在．BnTTl-1和BnTTl-2的基础上，可能还有1个以上的基因成员未克隆出来。 这是首次在甘蓝型油菜中克隆编码调控种皮发育和种皮色素合成与积累的锌指蛋白转录因子的基因。 2．BnTTl-1和BnITl-2具有复杂的基因结构和顺式调节方式BnTTl-1和BnTTl-2均有多种mRNA形式，最长的一种分别为1047bp和1013bp，均存在丰富的5'UTR长度和3'UTR长度的多态性。 BnTTl-1和BnTTl-2的3'UTR中分别有4种和2种不同的poly(A)加尾位置。选择性poly(A)加尾位置导致了BnTTl-1和BnITl-2的3’UTR的长度多态性。 BnTTl-1和BnTTl-2各有3种不同的mRNA起始碱基位置，不仅影响了5’UTR的位置和长度，也直接影响了ORF的大小和所编码蛋白的N端序列的长短。BnTTl-1和BnTFl-2以A<,1>作为起始碱基的mRNA的5'UTR中均嵌有一个ATG，起始密码子均向5'上游移动了39bp，ORF均延长为903bp，所编码蛋白在N末端均增加了13个氨基酸“MFSSLSNYCSPHS”。 BnlW-1和BnITl-2基因的5'编码区中相对于AtTTl发生了3处寡核酸缺失，它们在这3处分别比AtTTl缺失了4、2和9个氨基酸。 这种在同一个基因家族的两个成员中同时存在的选择性ORF长度、选择性转录起始位置和选择性poly(A)加尾位置的现象，在已报道的基因中，是极为罕见的。 此外，在BnTTl-1和BnTTl-2基因的5’UTR、3UTR和内含子区，分别鉴定了1个高度保守区，它们也许同样参与了基因表达的调控。 3．BnTTl-1和BnTTl-2是AtlTl在甘蓝型油菜中的对应基因BnTTl-1和BnTTl-2基因组序列的一致性为91.5％，它们在氨基酸水平的一致性为95.0％，相似性为96.7％，比核苷酸水平的一致性更高。 BnTTl-1和Bnl7l-2与来自拟南芥TTl基因(AtTTl)具有最高水平的同源性，基因组水平的一致性分别为64.9％和65.8％，ORF的一致性分别为80.6％和80.4％，氨基酸水平的一致性分别为76.3％和76.0％。 BnTTl-1和BnTTl-2的核酸序列与拟南芥TTl以外的WIP基因有较低的一致性，而与其它基因缺乏显著一致性。 聚类分析表明，BnTrl-1和BnTrl-2首先与AtTTl聚在一起，距离很近，然后与大豆GmWIPl聚为一个类型。该类型与其它WIP蛋白的距离相对较近，而与非WIP蛋白的距离则很远。 　　以上结果说明，BnTTl-1和BnTTl-2 AtTTl在甘蓝型油菜中的对应基因。 4.BnTTl-1和BnTTl-2与AtTTl一样，是典型的WIP锌指蛋白和AtTFl一样，BnTrl-1和BnTTl-2是核定位蛋白，具有和AtTTl中位置和序列完全一样的WIP特征性基序、N端富丝氨酸区、第一个锌指域C<,2>H<,2>，以及高度相似的第二个锌指域C<,2>HC。 BnTrl-1和BnTTl-2具有多处预测显著的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点，也许靠磷酸化作用是它们的翻译后修饰或活性转换机制。 BnTl-1和BnTTl-2的二级结构中随机卷曲最多(47.67％和49.67％)，其次是延伸链(23.33％和 21.67％)，a-螺旋(18.67％和19.00％)和B-转角(10.33％和9.67％)也有一定比例，符合锌指蛋白转录因子的结构特征。 总之，BnTTl-1和BnTrl-2是与拟南芥AtTrl高度相似的定位于细胞核的WIP亚类的C<,2>H<,2>型锌指蛋白，可能是象AtTTl一样的调控内种皮发育与种皮色素合成与积累的转录因子。 5.BnTTl的表达特征与AtTTl相似，且在黑籽、黄籽系问差异表达半定量RT-PCR表明，BnTTl-1和BnTTl-2的表达与AtTTl很相似，表达水平很低，并具有很强的时空特异性，主要在花和种子中表达。 近等基因黑籽系L1和黄籽系L2之间，花中BnTTl-1和BnTTl-2的表达水平并没有差异，但是L2的花后10天的幼种中这两个基因的表达水平极显著地低于L1。这可能说明TTl基因的表达下调是形成L2黄籽的一个重要原因。 6.构建了BnTTl基因家族反义植物表达载体。 采用sacl/BamHI双酶切定向克隆，将BnTTl-l和BnlTl-2共保守但又是TTl基因特异的411bp反义片段构建到pCambia2301中，转化根癌农杆菌形成工程菌，为进一步研究油菜TTl基因的功能创造了条件，也为创造种皮性状改良的新型转基因材料奠定了基础。

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1.引言

2.材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

5.结论

参考文献

缩写词

致谢

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