药源性鼠类肝损伤的微粒体GST1生物特征及相关巯基蛋白翻译后修饰研究

摘要

微粒体GST1(microsomal glutathione S-transferase1,MGST1)是一个Ⅱ相药物代谢酶,在体内分别催化两类反应,(1)催化还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)与亲电子物质的结合反应,使其毒性更低更易排出体外;(2)催化氧化应激产物和GSH的结合,而执行抗脂质过氧化功能。 MGST1最显著的特性体现在活性调控方面,其基因和蛋白表达水平都相对恒定;但多种翻译后修饰可成倍提高其催化活性,修饰位点一般位于酶活性中心第49位半胱氨酸残基(Cys49)上的巯基,例如巯基试剂N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide,NEM)和5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithionbis(2-nitrobenzonic acid),DTNB],及烷化剂等都可对Cys49特异性修饰而使酶催化区域得以激活。Cys49上的修饰方式还包括S-亚硝酰化修饰以及氧化修饰。另外,MGST1的酪氨酸(tyrosine,Tyr)也可发生硝基化修饰和分子间Tyr交联反应,后者导致二聚体形成,均可引起酶活性升高。上述MGST1各种修饰激活方式具有组织专属性,仅发生在哺乳动物肝脏,而其余组织,如小肠、肾上腺和睾丸所含的MGST1并不能被激活。可见MGST1激活现象是哺乳动物肝组织特有的一种保护机制,推测其在肝脏损伤过程中具有重要意义。对乙酰氨基酚(acetaminophen,AP)导致的肝脏损伤模型中,MGST1呈现短暂激活现象,但激活机制迄今未明。 MGST1激活的诸多修饰方式基本来自体外实验,如利用纯化的酶或微粒体,但其体内生物学意义并不明确。微粒体和纯酶的实验结果往往只代表一种体外的化学反应,在体内复杂的调控体系中并不一定具有实际意义;且文献报道大多缺乏直接的实验证据,结论一般来自间接推测,导致某些修饰方式仍存在较大争议。但在体内情况下,迄今尚无任何一种修饰方式被确切地验证过,所以MGST1体内激活机制是目前亟需解决的一个焦点问题。

目录

中文摘要

英文摘要

本课题创新点

前言

第一部分 大鼠肝微粒体MGST1的纯化及家兔抗MGST1多克隆抗体的制备

实验一 大鼠肝微粒体MGST1的层析纯化与酶催化动力学及激活特性研究

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

实验二 家兔抗大鼠MGST1多克隆抗体的制备及其初步应用

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第一部分结论

第二部分 NO供体或诱生型NO对大鼠MGST1及相关巯基蛋白的S-亚硝酰化修饰

引言

实验一 建立Biotin Switch法检测纯化的MGST1的体外S-亚硝酰化修饰

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

实验二 Biotin Switch法检测微粒体蛋白中MGST1是否存在S-亚硝酰化修饰方式

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

实验三 Biotin Switch法检测脂多糖诱导大鼠肝损伤模型中MGST1及相关巯基蛋白的S-亚硝酰化修饰

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

实验四 蛋白组学技术鉴定脂多糖诱导肝微粒体中的S-亚硝酰化修饰蛋白

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

实验五 醛缩酶的S-亚硝酰化修饰及功能调控

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第二部分结论

第三部分 MGST1在对乙酰氨基酚导致小鼠肝损伤模型中的修饰激活机制

引言

实验一 制备家兔抗N-乙酰-p-苯醌亚胺结合蛋白的多克隆抗体

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

实验二 检测对乙酰氨基酚肝损伤模型中MGST1与NAPQI结合的情况

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

实验三 检测对乙酰氨基酚肝损伤模型中MGST1是否存在硝基化修饰方式

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

实验四 对乙酰氨基酚肝损伤模型中MGST1的二聚体修饰方式

实验目的

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第三部分结论

参考文献

综述：活性氮对肝脏微粒体GST1的修饰激活研究进展

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