云南三种不同气候类型蛙类热驯化中HSP70表达差异的研究

摘要

热激蛋白70是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员，在应激条件下大量表达。它具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡以及肿瘤免疫治疗等独特复杂的生物学功能，因此，它的研究已成为生命科学领域研究的热点之一。目前热激蛋白70的研究所涉及的物种广泛，而对于两栖动物，尤其是有关不同气候类型两栖动物HSP70的研究比较少。全球性的两栖动物种群数量锐减已经得到科学界证实和重视，并且认为全球气候变暖是导致两栖动物锐减其中重要原因之一。两栖动物的特殊生物特性决定它们与环境之间的关系是最为密切的，而这种密切的关系可能与依赖热激蛋白70来实现有关，本文主要以采自昆明地区的黑斑蛙，西双版纳地区泽蛙，丽江地区双团棘胸蛙为实验动物。通过不同热驯化蛙类器官中的HSP70的Western blotting法测分析，研究不同器官的HSP70在时间和温度上的诱导表达变化以及HSP70作为生物标志物的可行性。探讨三个不同类型蛙类在相同驯化条件中热激蛋白70表达变化。初步了解气候变暖对三种不同气候类型蛙类影响。
　　 本研究方法如下：实验动物随机分组a、正常对照组；b、热驯化条件组，分为3个时间点(3h、6h、9h)和5个温度梯度(15℃，20℃，25℃，30℃，35℃)。应用Western blotting法测定蛙类肝脏、心脏、脑、皮肤、肌肉、脾脏器官HSP70的含量。
　　 实验一，昆明地区黑斑蛙在没有热驯化条件下，各器官的HSP70表达量多少排列：肝脏>皮肤>脑>心脏>肌肉>脾脏。结合实验的结果，选择了肝脏、皮肤、脑、心脏的HSP70表达量作为持续热应激的检测对象。
　　 实验二.三个地区蛙类各器官的HSP70表达差异表明，不同组织中HSP70有显著的诱导表达，表现出一定程度的波动性和规律性。
　　 丽江地区双团棘胸蛙驯化后结果显示，高温(35℃)对肝脏、脑、皮肤HSP70的诱导表达与25℃对照组相比有十分显著的作用(p<0.01)。低温15℃对肝脏、心脏、脑、皮肤的诱导表达与25℃对照组相比也有显著作用(p<0.01)。不同组织表达高峰在不同温度的不同驯化时间，其中肝脏和心脏的HSP70在35℃9h中有最高表达，分别是25℃驯化平均值的2.94倍和1.26倍；脑组织在15℃9h中有最高表达，是25℃驯化平均值的1.99倍；皮肤组织在30℃3h中有最高表达，是25℃驯化平均值的1.42倍。
　　 西双版纳泽蛙驯化后实验数据的t检验分析结果表明，高温(35℃)肝脏、心脏诱导表达有显著作用(p<0.01)。低温(15℃)对肝脏、心脏、脑、皮肤诱导表达也有显著作用(p<0.01)。不同组织表达高峰在不同温度的不同驯化时间，其中肝脏、脑和皮肤组织的HSP70在15℃9h中有最高表达，分别是25℃驯化平均值的4.19倍、1，80倍和1.70倍；心脏组织在15℃3h中有最高表达，是25℃驯化平均值的1.85倍。
　　 昆明地区黑斑蛙驯化后实验数据的t检验分析结果表明，高温(35℃)对脑、皮肤在不同时间诱导表达有显著作用(p<0.01)。低温(15℃)对肝脏、心脏、脑、皮肤不同时间诱导表达有显著作用(p<0.01)。不同组织表达高峰在不同温度的不同驯化时间，其中肝脏在15℃6h中有最高表达，是25℃驯化平均值的2.88倍；心脏组织在15℃3h中有最高表达，是25℃驯化平均值的2.69倍；脑和皮肤组织的HSP70在15℃9h中有最高表达，分别是25℃驯化平均值的1.41倍和2.15。
　　 综上所述，Western blotting检测结果进一步证明HSP70有热表达的特异性，该表达方式说明HSP70在蛙类热损伤保护中起着重要的作用。另外在丽江地区双团棘胸蛙在35℃的驯化过程中，出现大量死亡的个体，并且死亡的大多数是小个体，并且实验结果表明该地区的蛙类对高温抵抗力最低。而在版纳地区中的蛙类低温的驯化后的HSP70的表达比高温驯化后高，对高温的抵抗力最强，提示该地区的蛙类在长期的进化中已适应高温的生活环境。昆明地区的蛙类对过高过低温度敏感性最小，与该地区的蛙类是广温性蛙类有关。推测如果全球气候的急剧变化，可能对低温狭温性的蛙类造成一定的影响。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 引言

1.1 热激蛋白家族和HSP70的分类

1.2 HSP70的生物学功能

1.2.1 HSP70的分子伴侣作用

1.2.2 HSP70基因表达及调控

1.2.3 HSP70在机体中的保护作用

1.2.4 HSP70与发育关系

1.2.5 HSP70抗细胞凋亡和抗衰老作用

2 HSP70研究历史和现状

3 本研究目的与意义

4 材料与方法

4.1 主要试剂

4.2 主要仪器设备

4.4 消毒措施

4.5 样品采集与动物分组

4.6 检测项目与方法

4.6.1 组织中总蛋白制备与处理

4.6.2 牛血清白蛋白标准曲线制作、蛋白样品测定和计算

4.6.3 SDS-PAGE蛋白质电泳

4.6.4 免疫印迹

4.6.6 显色反应

4.6.7 数据分析

5 结果

5.1 黑斑蛙HSP70各器官中在常温件下的表达

5.2 三个地区蛙类的各器官在不同驯化条件下HSP70的表达

5.2.1 热驯化对三个地区蛙类肝脏组织HSP70诱导表达

5.2.2 热驯化对三个地区蛙类心脏组织HSP70诱导表达

5.2.3 热驯化对三个地区蛙类脑组织HSP70诱导表达

5.2.4 热驯化对三个地区蛙类皮肤组织70诱导表达

6 结果讨论与分析

6.1 三个地区的蛙经热驯化后HSP70的表达存在着显著的地区差异

6.1.1 温度狭适性两栖类在热驯化中HSP70表达特点

6.1.2 温度狭适性两栖类在热驯化中HSP70表达差异

6.2 蛙类在热驯化中各器官HSP70的表达变化

6.2.1 三个地区的蛙热驯化中肝脏组织HSP70的表达与温度变化的关系

6.2.2 三个地区的蛙热驯化中心肌组织HSP70的表达与温度变化的关系

6.2.3 三个地区的蛙热驯化中脑组织HSP70的表达与温度变化的关系

6.2.4 三个地区的蛙热驯化中皮肤组织HSP70的表达与温度变化的关系

6.3 温度变化对蛙器官中HSP70表达的意义

6.4 本课题有待进一步解决的问题

7 结论

参考文献

附录

致谢