云南三种野生稻籽粒淀粉合成关键酶活性测定及Waxy基因的克隆和分析

摘要

水稻是最重要的农作物之一，超过一半的人口以水稻为主食。随着人们生活水平的提高，对稻米的品质的要求也就越来越高。为了研究并利用野生稻直链淀粉较低的优良品质，探讨直链淀粉合成、调控的酶学机制，进而分离克隆直链淀粉合成关键酶基因，开展野生稻与栽培稻相关机制与基因的比较研究，对于开发利用野生稻优良品质基因，改良栽培稻品质具有重要意义。
　　 通过前期对这三种野生稻的直链淀粉含量的测定，其变化值为8.78％-12.99％，符合直链淀粉含量适中(9％-14％)的优良品质特性，开展云南野生稻与栽培稻灌浆期淀粉合成关键酶活性变化分析和直链淀粉合成关键酶基因Waxy分离克隆、比较研究，主要结果如下：
　　 1.在云南3种野生稻(普通野生稻Oryza rufipogon Griff药用野生稻Oryzaofficinalis Wall和疣粒野生稻Oryza granulata Baill)中4种淀粉合成酶(ADPG焦磷酸化酶(ADPGP)、颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(Q酶或SBE))的变化趋势与栽培稻相似，但这四种酶的活性有较大的差别。云南3种野生稻中GBSS的活性明显低于栽培稻.GBSS的活性与直链淀粉含量呈正相关。
　　 2.在云南3种野生稻同一灌浆期，同种材料中SSS和Q酶的变化呈相反趋势，推测这两种酶之间可能存在某种反馈调节机制。
　　 3.从普通野生稻中获得了从Waxy基因翻译起始密码子上游791bp开始的共4285bp的DNA序列，获得了完整的结构基因和从起始密码子到Poly(A)尾部2054bp编码区序列；从药用野生稻中获得了从Waxy基因的翻译起始密码子上游397bp开始的共3733bp的DNA序列，获得了完整的结构基因和从起始密码子到Poly(A)尾的2085bp编码区序列；从疣粒野生稻中获得了从Waxy基因的起始密码子开始的共3342bpDNA序列，包括起始密码子到Poly(A)尾的2065bp编码区序列；从栽培稻滇陇201中获得从Waxy基因的起始密码子上游1215bp开始的共4864bp的DNA序列，获得了完整的结构基因。
　　 4.普通野生稻、药用野生稻、疣粒野生稻的Waxy基因的DNA序列与栽培稻的有比较大的差异。Waxy基因的DNA序列在3种云南野生稻中也互不相同。在3种野生稻中，普通野生稻的Waxy基因与普通栽培稻之间相似性最高，其次是药用野生稻，而疣粒野生稻与普通栽培稻之间相似性最底。
　　 5.对3种云南野生稻的外显子和内含子进行了界定，表明普通野生稻的13个内含子将其Waxy基因分成14个外显子；药用野生稻的Waxy基因也有14个外显子和13个内含子，它们比普通栽培稻多一个外显子和一个内含子；疣粒野生稻有13个外显子和12个内含子。
　　 6.云南3种野生稻Waxy基因中推导的氨基酸序列与栽培稻之间存在着较大差异，在3种野生稻之间也有较大的差异。但Waxy基因的氨基酸序列的差异程度要小于其Waxy基因的DNA序列。这3种野生稻的WAXY蛋白预测的结构与栽培稻之间也有较大的差异，3种野生稻间也各不相同。所有的这些暗示在云南3种野生稻的Waxy基因中可能存在着不同于栽培稻的其它的调控机制来控制直链淀粉的含量。
　　 7.根据3种野生稻Waxy基因的DNA序列不同，在其差异较大的区域设计了3对特异的引物，可以用于这3种野生稻与栽培稻之间杂交后代的分子标记辅助选育。
　　 研究结果首次报道了云南3种野生稻直链淀粉合成关键酶的活性及其Waxy基因的序列，在一定程度上弄清了野生稻较低直链淀粉含量的酶学基础和关键基因的分子基础，为彻底揭示野生稻直链淀粉含量的分子机制打下基础。通过比较分析表明：将植物组织中总RNA的最常用的异硫氰酸胍法进行改进，即改良的异硫氰酸胍法适用于3种野生稻总RNA的提取，为进一步野生稻的分子生物学研究打下良好的基础。并且从3种野生稻中设计的3对特异的引物可以作为分子标记，为今后野生稻和栽培稻的分子辅助育种选育较低直链淀粉含量的优质稻奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 绪论

1.1 野生稻资源的分布

1.2 野生稻资源的现状

1.3 野生稻资源的重要性

1.4 淀粉合成关键酶研究进展

1.5 Waxy基因的研究进展

1.6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 淀粉合成关键酶活性的测定

2.1.1 供试材料

2.1.2 技术路线

2.2 Waxy基因的克隆

2.2.1 供试材料

2.2.1 技术路线

2.3 实验仪器、试剂与材料

2.3.1 主要实验仪器

2.3.2 主要试剂

2.4 实验方法

2.4.1 淀粉合成关键酶活性测定

2.4.2 Waxy基因的克隆

3 、结果与分析

3.1 淀粉合成关键酶活性测定

3.1.1 ADPG焦磷酸化酶活性变化

3.1.2 可溶性淀粉合成酶(SSS)活性变化

3.1.3 Q酶活性变化

3.1.4 颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS)活性变化

3.1.5 可溶性淀粉合成酶(SSS)和Q酶活性的比较

3.2 DNA提取结果

3.3 Waxy基因克隆结果

3.3.1 普通野生稻扩增结果

3.3.2 药用野生稻扩增结果

3.3.3 疣粒野生稻扩增结果

3.4 灌浆中期水稻籽粒总RNA提取

3.4.1 RNh完整性检测

3.4.2 RNA浓度与纯度测定

3.5 普通野生稻Waxy基因编码区克隆结果

3.6 DNA序列对比结果

3.6.1 翻译起始密码子ATG至Waxy基因末端的DNA序列对比结果

3.6.2 编码区序列比较结果

3.6.3 翻译的起始密码子ATG上游的基因序列进行比较

3.6.4 内含子和外显子界定结果

3.7 特异引物设计及其最佳反应条件

3.7.1 普通野生稻的特异引物及其最佳反应条件

3.7.2 药用野生稻的特异引物及其最佳反应条件

3.7.3 疣粒野生稻的特异引物及其最佳反应条件

3.7.4 滇陇201的特异引物及其最佳反应条件

3.8 野生稻WAXY蛋白质(GBSS蛋白质)分析

3.8.1 GBSS蛋白质序列分析

3.8.2 蛋白质二级结构预测

3.8.3 蛋白质高级结构预测

4 讨论

5 结论

参考文献

致 谢

附录

在读期间发表论文