CC亚族趋化因子受体6基因敲除对AppE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响

摘要

目的：心血管疾病已经成为威胁人类生命和健康的最常见疾病，也是全球关注的一大公共卫生问题，而动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)则是这类疾病发生、发展的一个重要病理学基础。研究证明趋化因子及其受体是参与动脉粥样硬化病程进展的关键因素，其在炎症细胞活化，进而迁入内膜和促进斑块形成的过程中扮演着至关重要的角色。CC亚族趋化因子受体6(CC chemokine receptor6，CCR6)是一种兼具有炎症和稳态功能的趋化因子受体类型，可以广泛表达于单核巨噬细胞、中性粒细胞等多种白细胞的亚型。其中巨噬细胞可大量吞噬氧化型低密度脂蛋白，并转化为巨噬细胞源性的泡沫细胞，进而促进了AS内膜斑块的形成和发展。并且研究表明，单核-巨噬细胞表达的单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)也参与了炎症过程和粥样硬化的进展。对于未被激活的单核巨噬细胞和中性粒细胞来说，CCR6的表达是低水平的，但是在动脉粥样硬化相关细胞因子的刺激下CCR6的表达水平将迅速升高。因此，我们推测CCR6对于AS斑块的形成、发展有重要影响。我们将借助CCR6基因敲除的ApoE-/-小鼠模型，进一步探讨CCR6对动脉粥样硬化的影响及其作用机制。
　　方法：⑴体外实验:培养巨噬细胞系RAW264.7细胞（小鼠来源），并应用构建成功的CCR6 siRNA干扰巨噬细胞的CCR6表达。然后通过噻唑蓝比色实验(MTT实验)及细胞迁移(Transwell)实验，进一步观察CCR6对RAW264.7巨噬细胞增殖能力和迁移能力的影响;Western blotting检测巨噬细胞MCP-1表达。⑵动物实验:杂交培育的双敲CCR6-/-ApoE-/-小鼠作为实验组(n=20只)，普通的单敲ApoE-/-小鼠作为对照组(n=20只)，给予高脂饮食饲养。12周后处死两组小鼠，然后主动脉根部快速取材固定，并制作冰冻切片，进行HE染色观察粥样斑块面积，利用油红O染色观察粥样斑块内脂质成分含量，并行免疫组化染色测定斑块内单核-巨噬细胞标志物(MOMA-2)和MCP-1的表达水平。
　　结果：①应用构建成功的CCR6 siRNA干扰RAW264.7巨噬细胞的CCR6表达后，巨噬细胞的增殖能力及迁移能力明显减弱(P＜0.05)。②与普通ApoE-/-小鼠（对照组）比较，CCR6-/-ApoE-/-小鼠（实验组）粥样斑块面积显著减小（16.1±2.0％vs8.3±1.9％，P＜0.05）;脂质含量明显降低（28.5±3.4％vs14.4±2.1％，P＜0.05）;并且AS粥样斑块内的MOMA-2及MCP-1的表达水平也显著降低(P＜0.05)。
　　结论：⑴利用siRNA干扰技术阻断CCR6可减弱巨噬细胞的增殖及迁移能力；⑵阻断CCR6可减少巨噬细胞MCP-1的表达；⑶CCR6通过促进脂质沉积和单核巨噬细胞的聚集，从而加速了动脉粥样硬化斑块的形成。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

1．实验材料

2．试验方法

3．统计学处理

结果

1．CCR6 siRNA抑制巨噬细胞的增殖及迁移能力

2．CCR6基因促进巨噬细胞MCP-1的表达

3．CCR6基因敲除抑制斑块内巨噬细胞聚集

4．CCR6基因敲除抑制AS斑块的形成

5．CCR6基因敲除抑制AS斑块内脂质沉积

讨论

1．趋化因子受体的种类

2．趋化因子受体CCR6在动脉粥样硬化发展过程中的作用

3．CCR6影响巨噬细胞的功能和活性

4．CCR6促进AS粥样斑块的形成

结论

附图及附表

参考文献

综述 趋化因子及其受体在动脉粥样硬化疾病中的作用

致谢

攻读学位期间发表的学术论文